Трансгенные мыши что это
Супермышцы супермышей Ученые вывели удивительно выносливых трансгенных грызунов
Мышцы модифицированных мышей мощнее. Миролюбивость мелких монстров меньше. Многое могут могучие маленькие млекопитающие. Мистика: медики меняли мало, минуя масштабные модификации. Мы, mutatis mutandis, можем модифицироваться?
Что могут супермыши
Наиболее знамениты трансгенные мыши своей выносливостью: они могут пробегать шесть километров со скоростью 20 метров в минуту почти без остановки. Многие источники почему-то настаивают на том, что тратят на это мыши шесть часов, однако в этом случае наблюдается некоторые несоответствие численных данных: то ли скорость на самом деле меньше, то ли они все же пробегают больше. Строго говоря, впечатления это особо не изменяет: исследователи говорят (и показывают), что обычные мыши сходят с дистанции на третьей сотне метров.
Почему они это могут
Изменили исследователи не так уж много: увеличили и «перенаправили» экспрессию гена, отвечающего за энзим PEPCK-C (фосфоенолпируват-карбоксикиназу), который участвует в глюконеогенезе: синтезе глюкозы из неуглеводных соединений.
Парвин Хакими, один из ведущих авторов исследования, занимался исследованием метаболической и физиологической функции PEPCK-C в жировых тканях и скелетных мышцах. В ходе исследований он вывел мышей с измененным содержанием PEPCK-C.
К чему это приведет
Трансгенные мыши и борьба со старением
Проблема
SENS Research Foundation разработал семь практических стратегий «ремонта» главных факторов старения. В то время как некоторые из этих стратегий в настоящее время широко изучаются научным сообществом, стратегия MitoSENS по борьбе с повреждением митохондрий является одной из самых новых. Наша теория заключается в том, что при помощи «аллотопической экспрессии», то есть путем помещения функциональных копий критических генов митохондриальной ДНК (мтДНК) в ядро клетки, можно устранить дефекты, возникающие из-за мутаций в мтДНК.
Когда это было предложено, эта уникальная и амбициозная стратегия была, возможно, слишком «смелой» для многих лабораторий и финансирующих организаций. Таким образом, MitoSENS был «внутренним» проектом SENS, который был бы невозможен без поддержки сообщества. Пока что этот подход, финансируемый сообществом, имеет отличную историю, ведущую к революционным открытиям.
В 2013 году SENS организовал свою первую краудфандинговую кампанию специально для MitoSENS в партнёрстве с LongeCity. Эта небольшая инициатива вызвала значительный интерес и проложила путь к более крупному сбору средств в 2015 году на сайте Lifespan.io. За этим последовали прорывные открытия, и впервые в человеческих клетках учёные показали принципиальную работу подхода MitoSENS.
Чтобы приблизить его клиническое применение, SRF вскоре создал «максимально изменяемую модель мыши». У этой мыши есть уникальная модификация в их ядерном геноме, которая позволяет целевую вставку новых генов в конкретном месте. Используя эту мышь, мы готовы сделать следующий шаг и продолжить митохондриальную генную терапию на животной модели.
Решение
Мыши C57/BL6MT-FVB линии (назовём их «Больными Мышами» ) имеют генетический дефект (мутация в митохондриальном гене ATP8) и проявляют несколько возрастных симптомов, включая снижение фертильности, артрит, сахарный диабет II типа и неврологические нарушения. Поскольку митохондриальная ДНК наследуется лишь по матери, скрещивание самки Больной Мыши с самцами мышей из иных линий приведёт к этой же дисфункции митохондрий.
Мы будем использовать максимально изменяемую модель мыши для проектирования новой трансгенной мыши («аллотопная АТР8 трансгенная мышь – МитоМышь»). У этой мыши будет ген ATP8, важный для митохондриальной функции, «скрытый» в ядре клетки и, следовательно, способный передаваться потомству независимо от пола.
Наша гипотеза заключается в том, что как самцы, так и самки в потомстве Больной Мыши и МитоМыши покажут восстановленные митохондриальные функции. Это означало бы жизнеспособность стратегии MitoSENS, показав, что функциональные резервные копии генов митохондриальной ДНК в ядре могут заменить их мутировавшие аналоги у живых животных.
Наконец, мышей оценят на фенотипические улучшения, такие как поведенческие, физиологические и биохимические изменения. Успех проекта заложит основу для успешной генной терапии у людей.
Болейте за нас
Зачем для вакцины от COVID-19 нужны трансгенные мыши
В Институте биологии гена РАН создают первую «партию» генно-модифицированных мышей, которые болели бы COVID-19 как люди. Животные в июне отправятся на эксперименты под Новосибирск — в вирусологический центр «Вектор», которому подобные манипуляции разрешены Роспотребнадзором. О том, зачем нужны «коронавирусные» мыши, и с какими сложностями могут столкнуться исследователи при их создании, N + 1 рассказал Алексей Дейкин, руководитель Центра коллективного пользования «Геномное редактирование» ИБГ РАН.
Почему мыши
Мыши и крысы слабо подвержены заражению новым коронавирусом. Теоретически, можно дать им настолько большую вирусную нагрузку, что у них возникнут симптомы, но это будет абсолютно не соответствовать тому, как болеет человек: вероятнее всего, они просто начнут терять массу, не более того. С этой проблемой столкнулись еще в 2003 году, когда была вспышка первого SARS. Тогда тоже создавали генетически модифицированных мышей, которые были бы чувствительны к этому вирусу.
Лабораторных животных, которых можно было бы использовать в качестве полноценных моделей для изучения коронавирусной инфекции, практически нет. Коронавирусом SARS-CoV-2 могут заражаться хорьки, обезьяны, есть данные о том, что заражаются хомяки — и способны заражать друг друга.
Но для полноценной работы по разработке средств от COVID-19 необходимо соблюсти два условия.
На модельном организме должно воспроизводиться «человеческое» течение болезни — весь ее патогенез, который свойственен именно человеку.
Чтобы получить статистически значимые результаты о безопасности и эффективности лекарства или вакцины, чтобы обнаружить все, даже очень редкие побочные эффекты, нужны тысячи, а то и десятки тысяч подопытных животных.
И в случае с SARS-CoV-2 оба эти условия пока не выполняются ни для одного модельного организма.
У тех же хорьков нет обычной для человека респираторной симптоматики, они не кашляют. У них реализуется желудочно-кишечный фенотип болезни. А у людей кишечные симптомы далеко не самые частые и не самые главные. Следовательно, проверка человеческого лекарства на хорьках не будет вполне показательной.
Патогенез болезни у обезьян больше похож на человеческий, но здесь возникает вторая проблема. Очень важно, чтобы эксперименты на животных были достоверными, чтобы мы увидели реальную смертность, реальную вероятность побочных эффектов.
Представьте, что у вакцины вероятность какого-то тяжелого побочного эффекта один случай на 10 тысяч. Вы провели эксперимент на тысяче животных, на тысяче человек, и не увидели этот эффект.
А потом эту вакцину получают 100 тысяч человек – и это потенциальные десять смертей. А если речь идет о миллионах людей? Единственным надежным инструментом здесь могут быть массовые проверки на лабораторных животных.
Эксперимент даже на тысяче обезьян невозможно представить. Сейчас, например, «Вектор» купил 20 обезьян, и больше в российских питомниках обезьян нет. Даже на тысяче хорьков исследование малореально, потому что это очень агрессивные животные, которых сложно содержать. А вот тысячу мышей можно поместить в комнату площадью 20 квадратных метров.
Трудности трансгенеза
«Старый» SARS-CoV для проникновения в клетку использует рецептор ACE2 на поверхности эпителия верхних дыхательных путей и легких. В 2005-2007 году было создано несколько модельных мышей, которые, к сожалению, оказались неудачными. Во всех случаях ученые пытались путем трансгенеза экспрессировать человеческий ACE2 в организме мыши, но под разными регуляторными элементами, которые заставляли бы рецептор синтезироваться в большем или меньшем количестве. О тканеспецифичной экспрессии ACE2 — то есть чтобы тот появлялся только, собственно, в легких — исследователи не задумывались. Поэтому рецептор экспрессировался и там, где, по идее, не должен, — например, в мозге.
Из-за того что генетическая кассета с ACE2 встраивалась случайно, эти мыши после инфицирования болели очень по-разному. В зависимости от количества встроившихся копий гена они или не показывали вообще никаких симптомов, или наоборот, в муках умирали на второй-третий день после инфекции — в первую очередь, от поражения мозга.
Мыши-реципиенты, которым переведены яйцеклетки после микроинъекции конструкции с геном hACE2
Предоставлено Алексеем Дейкиным
Китайцы сделали трансгенную мышь, у которой экспрессия человеческого ACE2 контролировалась человеческим же промотором. Это должно было обеспечить его более правильную работу, соответствующую работе гена у человека. Эти мыши заражались первым SARS, но болели очень слабо: среди симптомов были только снижение массы тела и вялость. А новым коронавирусом они заражаются еще слабее – болезнь протекает практически без симптомов.
В 2013 году появились сообщения, что для проникновения вируса в клетку нужен не только рецептор ACE2, но и второй белок, TMPRSS2. Это сериновая протеаза, которая активирует белок на поверхности вируса, за счет этого запускается альтернативный путь проникновения вируса в клетку.
На культуре клеток было показано, что ингибитор, препятствующий связыванию TMPRSS2 с вирусом, блокирует заражение клеток. Это означает, что путь, связанный с взаимодействием TMPRSS2 и ACE2, может быть даже более важен, чем проникновение с помощью ACE2.
Это подтверждается статьей в Nature, вышедшей 26 апреля, где сравниваются профили экспрессии ACE2 и TMPRSS2. Там было показано, что страдают именно те клетки, где эти два гена, два белка экспрессируются одновременно. Это эпителий верхних дыхательных путей, альвеолоциты второго типа, клетки роговицы глаза, несколько меньше в кишечнике и в тестикулах. Эти два рецептора все чаще упоминаются вместе, если речь идёт про COVID-19. Но на сегодняшний день животного-модели с этими двумя «очеловеченными» генами нет.
Мы считаем, что желательная — не знаю, насколько идеальная — животная модель COVID-19 должна характеризоваться тремя признаками.
Первое: чтобы у них были оба гена, ACE2 и TMPRSS2.
Второе: чтобы эти гены экспрессировались так же, как у человека, в определенных тканях.
Третье: чтобы они не экспрессировались тогда, когда нам это не нужно, то есть за пределами вирусологической лаборатории.
Коронавирусность по сигналу
Возможность «выключать» способность заражаться коронавирусом в условиях пандемии необходима — на этих мышей может кашлянуть лаборант, и если они будут такие чувствительные, то заболеют и умрут безо всякого толка. А по некоторым данным, у очень многих людей болезнь протекает бессимптомно.
Наши опасения подтверждаются ситуацией в Нидерландах, где в 20-х числах апреля были закрыты норковые фермы. Норки чувствительны к заражению этим вирусом: они заразились от персонала, начали массово гибнуть. Фермы закрыты — вплоть до того, что навоз вывозить некому.
Чтобы такого в наших питомниках не случилось, где мышей размножают, или не случилось в процессе транспортировки, мы создаем мышей, где экспрессия человеческих генов запускается по сигналу.
Здесь мы используем технологию с использованием вирусного фермента Cre-рекомбиназы. Этот белок узнает в геноме определенные последовательности, которые называются LoxP-сайты, и использует их для вырезания куска ДНК. То есть, если мы какой-то генетический элемент окружим этими LoxP и затем включим экспрессию Cre-рекомбиназы, этот элемент вырежется.
Этой технологии уже 20-30 лет. Есть большое количество мышей, которые в разных органах и тканях экспрессируют Cre-рекомбиназу. Есть мыши, у которых, например, в тканях лёгких экспрессируется Cre-рекомбиназа, а в печени не экспрессируется. Причем есть мыши, где экспрессия этой Cre-рекомбиназы запускается только после того, как, например, мышь накормили антибиотиком доксициклином. Их не нужно создавать, их можно просто купить.
Мы собираем такую генетическую конструкцию. Она будет состоять из кодирующих последовательностей двух человеческих белков, TMPRSS2 и ACE2. Между ними будет регуляторный элемент, который обеспечит их одновременную работу в клетке. А перед ними будет стоять стоп-кассета, окруженная LoxP-сайтами. Вот эта конструкция вставляется в геном мыши в область, где находится ее собственный ген TMPRSS2.
Когда клетка дифференцируется, становится, например, альвеолоцитом второго типа, она запускает экспрессию характерного для нее гена, этого TMPRSS2. Но когда начинает работать промотор TMPRSS2, он начинает сканировать нашу конструкцию. А под мышиным промотором начинает работать два человеческих гена. Но начнут они работать только тогда, когда будет удалена стоп-кассета, которая находится между ними и промотором. А удалена она будет только после скрещивания с соответствующими Cre-мышами.
Трансгенные мыши помогут одолеть коронавирус
Нариман Баттулин и Алексей Кораблёв, специалист по трансгенным мышам. Фото с сайта pcr.news
Голые и ярко-розовые новорожденные мышата шебуршат вокруг мамы-мыши. Я смотрю на них со смесью умиления, интереса и сочувствия — ведь это генетически модифицированные лабораторные грызуны, которые, как надеются ученые, будут восприимчивы к COVID-19. Подробности рассказывает Нариман Баттулин, руководитель этого проекта, заведующий лабораторией генетики развития Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.
— Насколько я понимаю, мыши по умолчанию невосприимчивы к ковиду. На ком тестируют вакцины и лекарства сейчас?
— Обычно используют животных, которых можно заразить СOVID-19: хорьков или обезьян; китайцы, например, ставили эксперименты на макаках. Но такие тесты дороги, и доступ к экзотическим животным есть далеко не у всех. Ну, а безопасность вакцины можно тестировать и на мышах, невосприимчивых к вирусу.
— Как вам удалось получить этих трансгенных мышей?
— Начали мы с того, что написали заявку на грант РФФИ (и ожидаем его получить — точно об этом станет известно в середине июля). И в рамках проекта обещали сделать три линии мышей. Те мышата, которых вы видели, получены самым простым способом из трех запланированных.
Коронавирус SARS-CoV-2 проникает в клетки человека через ангиотензинпревращающий фермент АСЕ-2 (мембранный белок, который является рецептором и точкой входа для целого ряда коронавирусов). У мышей и человека эти ферменты различаются, именно поэтому COVID-19 не может проникать в мышиные клетки. Мы взяли человеческий ген ACE-2 и встроили его в мышиный геном — технически сделать это несложно. Но мы предполагаем, что протекать заболевание у наших генно-модифицированных мышек будет по-другому. Дело в том, что фермент АСЕ-2 у человека работает не во всех клетках; именно поэтому во время болезни клетки легких повреждаются, а клетки кожи — нет. Мы ожидаем, что болезнь у мышей будет протекать сложнее. Но тестировать вакцину, если всё сработало, точно будет можно.
— А что из себя будут представлять две другие линии?
— Мы работаем над тем, чтобы ген работал не во всех клетках, а только там, где он должен работать.
Во втором случае ген ангиотензинпревращающего фермента — человеческий, а контролирует его экспрессию мышиный ген. Технически это реализовать сложнее: конструкции достаточно большие, и ввести их нужно в конкретное место мышиного генома. Но сейчас мы застряли на подготовительном этапе. Есть организации, которые синтезируют ДНК на заказ; во всём мире ученые просто заказывают синтез необходимых ДНК. Обычно на производство нужной ДНК уходит всего несколько дней. Но проблема в том, что сегодня из-за пандемии все эти организации заняты производством тестов. Так что пока ждем.
В третьем варианте мы бы хотели изменить конфигурацию мышиного фермента так, чтобы с ним смог связываться вирус COVID-19. То есть мы хотим заменить мышиные последовательности генов на человеческие только в тех местах, которые не дают вирусу связываться с белком. Казалось бы, это всего несколько аминокислот. Но это в пространстве на белке изменения находятся в одном месте, а в линейном гене — разбросаны по трем разным экзонам. Этот вариант хоть и самый сложный, но он сохраняет мышиный белок. А это значит, что с другими белками, протеазами, он будет взаимодействовать как «родной». Мы минимально вмешиваемся в регуляцию гена и в белок-белковые взаимодействия, которые есть в организме.
— То есть самые большие успехи на сегодняшний день по первому варианту?
— Да. 28 мышат. Когда они немного подрастут, их ждет генотипирование, — это позволит нам понять, насколько успешно встроились человеческие гены в мышиный геном. По опыту предыдущих аналогичных работ ожидаю 50% успеха.
— Что же ждет тех мышат, которые могут заразиться COVID-19?
— Они станут родоначальниками линии. Хорошо, что манипуляции с встраиванием гена нам приходится делать лишь один раз — при размножении эта мутация переходит потомкам. Так что мы получим от них потомство, а их самих отправим в центр «Вектор».
— Правильно ли я понимаю, что такие мыши уже выведены за рубежом? Если это так, зачем создавать новых?
— Тут надо сказать, что COVID-19 заходит через тот же белок, через который проникал в клетки SARS-CoV. Вспышка SARS-CoV была в 2003 году, а к 2007-му были созданы четыре модели мышей под вирус SARS-CoV. Но из-за схожих механизмов для COVID-19 они тоже работают. Одна из созданных тогда линий доступна сегодня в Jackson Laboratory (США). В начале пандемии эти мыши были в состоянии замороженных сперматозоидов, но, тем не менее, уже в начале марта у лаборатории заказали более трех тысяч животных. Мы в этой очереди ожидающих были бы далеко не первыми. Насколько мне известно, первых животных совсем недавно лаборатория уже начала рассылать. Подтвердилась восприимчивость к коронавирусу COVID-19 и у мышей, выведенных в Китае также после пандемии 2003 года.
Кроме сложностей с ожиданием есть и еще один нюанс. Покупка животных из-за рубежа всегда сопряжена с проблемами, а сегодня к существующим проблемам стоит добавить новые, связанные с пандемией.
Нам показалось, что проще всё сделать самим. В России таких мышей до этого года не было. Но в конце мая родилось первое поколение трансгенных мышат у группы в Институте биологии гена РАН. И вот сейчас такие мыши появились и в нашей лаборатории.
— Когда вы сможете предоставлять животных для тестирования противовирусных лекарств и вакцин?
— Первые мышата родились 23 июня. Через 4–6 недель после появления на свет они смогут приносить потомство. Поэтому к началу сентября мы сможем передать первую партию для экспериментов. С мышами по второму и третьему вариантам делать предсказания сложнее: мы пока не можем оценить эффективность стратегии. Но предположительно (если нам удастся в ближайшее время получить синтезированную ДНК), мышата в рамках второго варианта появятся к концу августа. В третьем варианте, если нам удастся модифицировать все три участка одновременно («гусарским наскоком»), мы получим первых мышат с такой модификацией до осени. Если придется делать замены последовательно (пойти «путем улитки») — в феврале-марте следующего года.
— «Мы встроили человеческий ген в мышиный геном» — звучит очень просто. Но я подозреваю, что в реальности вам приходится сталкиваться с техническими сложностями.
— В целом процедура очень похожа на ту, что проводят в человеческих ЭКО-клиниках. Важное отличие только в том, что наши «пациенты» размером меньше ладони. Подробности всего процесса можно увидеть на YouTube-канале «Чуть-чуть о науке», вместе с которым мы решили снять сериал про создание мышей, чувствительных к COVID-19.
— Как влияет на скорость вашей работы ситуация с коронавирусом в стране и в мире? Вы уже упоминали про сложности с получением заказа синтезированных ДНК.
— Это раз. Второе — это финансовые сложности. Результаты нужно получить как можно быстрее, желательно уже за ближайшие полгода, а деньги традиционно распределяют в конце года. (Даже на самые актуальные проекты и гранты деньги обычно просят за полгода — год.) Первые финансы на проект выделил институт, потом использовались деньги лаборатории, в будущем надеемся на грант РФФИ. Третье — над проектом работают люди, не защищенные от болезни и от контакта с заболевшими. Наш сотрудник, на котором в значительной мере держится «мышиная» часть, через третьих лиц контактировал с заболевшим коронавирусом. Из-за этого он ушел на самоизоляцию (из-за риска заразить всю лабораторию), и у нас чуть было не встал весь процесс. Однако опасения не подтвердились, и сейчас мы уже продолжаем работу.