rahnella aquatilis что это
федеральное бюджетное учреждение здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Марий Эл»
Помимо этих, уже ставших «хрестоматийными» возбудителями, внимание к энтеробактериям привлекает существенно возрастающее значение условно-патогенных видов, а также представителей, традиционно считавшихся непатогенными. С одной стороны, это связано с увеличением числа лиц пожилого возраста, страдающих как правило, различными хроническими заболеваниями. Кроме того, в этой возрастной группе многие пациенты вынуждены длительно принимать глюкокортикоиды и цитостатики. При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности организма, энтеробактерии могут проникать в различные ткани и вызывать до 50% всех случаев бактериемий, более 70% инфекций мочевыводящих путей и поражение других органов.
С другой стороны, значительно увеличилась частота применения инвазивных диагностических и лечебных процедур (например, использование длительно функционирующих катетеров), облегчающих проникновение энтеробактерий во внутреннюю среду организма человека. Поскольку патогенный потенциал большинства условно-патогенных энтеробактерий достаточно невелик, то он, естественно, чаще реализуется в виде госпитальных поражений.
Особую группу составляют поражения, ранее не связываемые с энтеробактериями. В частности, они вызывают до 2-4% бактериальных менингитов. При подобных поражениях летальность может достигать 87%, что представляет собой абсолютный рекорд среди всех возбудителей заболевания.
Таким образом, представители семейства Enterobacteriaceae составляют большую проблему для здравоохранения. С точки зрения бактериологии, несомненным критерием их медицинской значимости выступает постоянное появление новых автоматических и полуавтоматических систем индикации энтеробактерий. И ни для какого другого семейства или групп бактерий не разработано такого обилия идентифицирующих тестов, а также селективных и дифференциально-диагностических сред для их выделения.
ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОТОКСИНОВ RAHNELLA AQUATILIS (ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ)
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, г. Киев
Rahnella aquatilis является относительно новым видом Enterobacteriaceae, который был описан исследователями в 1976—1979 гг. [1, 2]. Кроме открытых водоемов, Rahnella aquatilis изолировали из почвы (чаще всего из ризосферы злаковых: пшеницы, кукурузы, риса), а также клинического материала. Они являются патогенными агентами, вызывающими заболевание мочеполовой системы, органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта. Как и другие условно-патогенные бактерии, штамы Rahnella aquatilis характеризуются широким клиническим спектром заболеваний (рахнеллезов), который они вызывают. Известно, что ведущую роль в патогенезе заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями, играют эндотоксины (липополисахариды). Что касается Rahnella aquatilis, то, кроме одной нашей статьи [3], в литературе отсутствуют данные по изолированию и химической характеристике их липополисахаридов, что и явилось целью данной работы.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили 2 штамма Rahnella aquatilis ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенных из испражнений больных диареей в лаборатории новых и малоизученных инфекционных заболеваний Института микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины (г. Харьков). Культуры Rahnella aquatilis были любезно предоставлены нам зав. лаболаторией, канд. мед. наук С.И. Похилом.
Культуры выращивали в матрацах с МПА в течение 24 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 5000 об 40 мин, высушивали обработкой ацетоном и эфиром.
Выделение и очистку липополисахаридов проводили по методу [4]. ЛПС экстрагировали из высушенных клеток водным фенолом при 65—68°С. Водный слой диализировали против водопроводной, затем дистиллированной воды, очищали от нуклеиновых кислот путем осаждения насыщенным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и трехкратного ценрифугирования при 144.000 g 40 мин, после чего лиофилизировали.
Фракции ЛПС анализировали на наличие белка по методу [5], углеводов — [6], нуклеиновых кислот — [7]. Гептозы определяли реакцией с цистеином и серной кислотой [8], содержание 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО) — реакцией с тиобарбитуровой кислотой [9]. Фракцию липида А получали путем кислотного гидролиза в 4% уксусной кислоте (12—14 ч, 100°С). Фракции, соответствующие О-специфической полисахаридной цепи и олигосахариду кора выделяли гель-фильтрацией углеводной части деградированного ЛПС на колонке с сефадексом используя пиридин-ацетатный буфер (рН 5,0).
Для идентификации нейтральных моносахаридов препараты гидролизировали 2N HCl в течение 5 ч при 100°С, а затем анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов [10] на приборе марки «Chrom-5» с пламенно-ионизационным детектором на колонке (3,0 мм1,2 м) с неопентилсукцинатом на хромосорбе W (80—100 меш) при режиме хроматографии 170—200°C (3°С/мин).
Содержание аминокислот и гексозаминов определяли после гидролиза 6N HCl в течение 20 ч при 100°С на анализаторе аминокислот KLA-5 («Hitachi», Япония).
Электрофорез ЛПС проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в системе додецилсульфата натрия согласно метода [11]. Препараты ЛПС после электрофоретического распределения окрашивали азотнокислым серебром согласно метода [12].
Антисыворотку к гретой (2,5 ч, 100°С) культуре типового штамм 33071 R. aquatilis получали в результате четырёх внутривенных иммунизаций кроликов возрастающими дозами суспензии микробных тел (от 2?106 до 5?107 клеток/мл) с интервалами между инъекциями 7 суток. Животных обескровливали на сут после последней инъекции.
Антигенную активность ЛПС изучали реакцией двойной иммунодиффузии в агаре по методу Оухтерлони [13]. Имуноэлектрофорез проводили с использованием двух модификаций: микроэлектрофореза [14] и ракетного электрофореза [15].
Результаты и их обсуждение
В современной литературе практически не встречаются работы, посвященные изучению ЛПС R. aquatilis. Поэтому нами были получены и химически охарактеризованы ЛПС R. aquatilis штаммов ЛЭПМД 95U003 и 95U004, выделенные из испражнений больных диареей.
Несмотря на то, что экстракция ЛПС проводилась в одинаковых условиях, их относительное содержание у штаммов 95U003 и 95U004 несколько отличалось: конечный выход препаратов по отношению к сухому весу клетки составлял 15,8 и 11,7%, соответственно.
Известно, что при выделении ЛПС в тех случаях, когда необходимо получить препараты, характеризующиеся высоким содержанием углеводов и минимальным количеством примесей белковой природы, особое предпочтение отдается методу водно-фенольной экстракции. Однако, наряду с преимуществами, этот метод обладает рядом недостатков. С одной стороны, при экстрагировании ЛПС горячим фенолом может происходить расщепление чувствительных к растворителю связей внутри молекулы липида А, что обусловливает частичную деградацию ЛПС. С другой стороны, водно-фенольный метод используется и для выделения нуклеиновых кислот, которые экстрагируются в фенольный слой смеси, в то время как ЛПС — в водный слой. Такой метод получения препаратов ЛПС может обусловливать повышенное содержание в нем нуклеиновых кислот в качестве примесей. Эта проблема эффективно решается при использовании нескольких циклов ультрацентрифугирования и/или осаждения насыщенным раствором ТХУ, образующей с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. В очищенных препаратах ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis содержалось углеводов 64 и 85,5%, белка 0,8 и 1,6%, нуклеиновых кислот — 0,4 и 0,6%, соответственно (табл. 1).
Изучение моносахаридного состава ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis (табл. 2) показало, что доминирующими моносахаридами являются галактоза, манноза и глюкоза. Содержание рамнозы в ЛПС шт. 95u004 приблизительно в 4 раза выше, а арабинозы — ниже, чем в ЛПС шт. 95u003. Из гексозаминов обнаружен глюкозамин 0,5 и 4,7% в шт. 95u003 и 95u004, соответственно, галактозамин присутствовал только в составе ЛПС шт 95u004 (0,7%).
В ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis были выявлены компоненты олигосахарида кора: L-глицеро-D-манногептоза и 2-кето-3-дезокси-D-маннооктоновая кислота (КДО), которые редко встречаются в других природных биополимерах (табл. 2). Содержание гептоз в ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis 95U003 и 95U004, составило 2,2 и 6,3%, соответственно. КДО в препаратах недеградированных ЛПС была выявлена в следовых количествах — 0,07 и 0,03%, соответственно. КДО является единственным структурным компонентом, который присутствует во всех ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Бактерии с дефектом в биосинтезе КДО не являются жизнеспособными. Это указывает на то, что КДО абсолютно необходима для структурной и функциональной целостности бактериальной клетки. Однако неспособность выявить КДО в недеградированном ЛПС обусловлена сложностью ее структуры. Она является полифункциональной сахарной кислотой с 8 атомами углерода, несущими карбоксильную, гидроксильную, кето- и дезоксигруппы. Этот факт объясняет чрезвычайную чувствительность КДО к действию кислот и других химических реактивов.
Анализ состава аминокислот ЛПС R. aquatilis (табл. 3) показал, что эти вещества присутствуют в незначительных количествах: от 0,10 до 1,32%. Преобладающими для ЛПС шт.95u003 r. aquatilis были глутаминовая кислота, гистидин, глицин и аланин, а для шт.95u004 — глутаминовая кислота, глицин, аспарагиновая кислота, гистидин и аланин.
ЛПС представляет собой комплексную молекулу, в которой углеводная часть присоединена к липиду А гликозидной связью остатка КДО. Эта связь отличается высокой кислотолабильностью, поэтому она может быть избирательно расщеплена в условиях мягкого кислотного гидролиза. Благодаря этому ЛПС можно легко разделить на нерастворимый в воде липид А и водорастворимый углеводный материал (так называемый деградированный липополисахарид). Характерным свойством ЛПС штаммов 95U003 и 95U004 R. aquatilis является то, что для расщепления связи между углеводной частью и липидом А необходимы более жесткие условия гидролиза (4% уксусная кислота, 12—14 ч, 100°С) по сравнению с ЛПС других грамотрицательных бактерий (1% уксусная кислота, 1,5—2 ч, 100°С). Это свидетельствует об устойчивости кетозидной связи в ЛПС исследованных штаммов R. aquatilis. Выход липида А в результате деградации незначительный (5,2 и 7,8%, соответственно для шт. 95U003 и 95U004). Другие структурные компоненты — О-специфический полисахарид (фракция І) и олигосахарид кора (фракции ІІ и ІІІ) получали после гель-фильтрации на сефадексе углеводной части деградированных молекул ЛПС исследуемых штаммов R. aquatilis. Профили элюции углеводной части (рис. 1 и 2) указывают на то, что в исходных ЛПС, а следовательно, и в популяции бактерий исследуемых штаммов, содержится ЛПС в s- и r-формах: преобладающими являются высокомолекулярные фракции однако, присутствуют и низкомолекулярные фракции ОГ-кора. Такого рода гетерогенность может иметь биологическое значение, поскольку она способствует более плотной упаковке молекул ЛПС s- и r-форм на клеточной поверхности.
Изучение моносахаридного состава и ОГ-кора исследуемых штаммов показало, что в качестве основных нейтральных моносахаридов присутствуют галактоза, глюкоза, манноза. Кроме того, в и ОГ-кора шт. 95U004 присутствовала фукоза, а рамноза в незначительном количестве была выявлена в шт. 95U004 и ОГ-кора шт. 95U003 (табл. 2).
Как и в исходных молекулах ЛПС исследуемых штаммов, так и в их и ОГ-кора присутствовали аминокислоты: преобладающими являются глицин и глутаминовая кислота — R. aquatilis шт. 95U003; метионин, серин, глутаминовая кислота и изолейцин — R. aquatilis шт. 95U004 (табл. 3).
До недавнего времени считали, что аминокислоты, которые определяются в ЛПС, являются следствием загрязнения его белком при выделении. Однако в последние годы установлено, что аминокислоты могут входить в состав ЛПС. Так, установлено [16], что необычным свойством Proteus mirabilis О27 является присутствие в неуглеводных заместителей: двух аминокислот — L-лизина и L-аланина, присоединенных через амидную группу к карбоксильным группам уроновых кислот, и этаноламина, присоединенного в положении 6-N-ацетилглюкозамина фосфодиэфирной связью. Авторы предположили, что аминосоединения играют определенную роль в проявлении биологической активности. В дальнейшем были обнаружены L-серин и L-лизин в структуре P. mirabilis О28. Показано, что поликлональная антисыворотка узнает эпитоп, содержащий D-GalpA-лизин (а не D-GalpA-Ser), в котором остаток галактуроновой кислоты играет иммунодоминантную роль.
ДСН-ПААГ электрофорез ЛПС исследуемых штаммов показал типичное для ЛПС S-формы бимодальное распределение. ЛПС в клетках представлены гетерогенной популяцией, которая включает два основных типа молекул: высокомолекулярный с О-цепями разной длины и низкомолекулярный который не содержит О-специфических полисахаридных звеньев. При электрофоретическом исследовании удалось выявить также менее выраженную фракцию SR-ЛПС с малым числом мономерных звеньев в О-цепи (рис. 3).
При исследовании антигенных свойств ЛПС шт. 95U003 и 95U004 R. aquatilis в качестве антител использовали поликлональную О-антисыворотку, полученную к убитой нагреванием культуре типового штамма 33071 R. aquatilis.
В реакциях двойной иммунодиффузии в агаре по Оухтерлони, иммуноэлектрофореза и ракетного иммуноэлектрофореза ЛПС R. aquatilis штаммов 95U003 95U004 перекрестно реагировали с антисывороткой к типовому штамму R. aquatilis ATCC 33071 (рис. 4, 5 и 6), что свидетельствует о наличии у них общих антигенных детерминант, то-есть о принадлежности исследуемых штаммов к одной и той же серогруппе, что и типовой штамм.
Таким образом, из двух штаммов R. aquatilis, выделенных из испражнений больных диареей, изолированы липополисахариды (эндотоксины), проведена их химическая идентификация, изучен мономерный состав. Показано, что R. aquatilis 95U003 и 95U004 проявляют перекрестные серологические реакции с типовым штаммом 33071. Эти данные дают основание предположить аналогию в структуре их О-специфических полисахаридных цепей, которые являются ответственными за О-антигенную специфичность липополисахаридов.
Штаммы бактерий родов bacillus, pseudomonas, rahnella, serratia, обладающие фитопротекторной и ростостимулирующей активностью, и препарат на основе этих штаммов
Владельцы патента RU 2595405:
Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения микробных препаратов на основе смеси штаммов бактерий для оздоровления биоценоза, ускорения разложения лигноцеллюлозы, повышения урожая сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.
Основу изобретения составляют бактерии Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, Pseudomonas brassicaceamm ВКПМ В-11984, Rahnella aquatilis ВКПМ В-11985, Serratia plymuthica ВКПМ В-12008, обладающие фитопротекторными, целлюлолитическими и ростостимулирующими свойствами, и препарат на основе этих штаммов, снижающий инфекционный фон в период вегетации растений, обеспечивающий оздоровление биоценоза, ускорение разложения соломы и пожнивных остатков, стимулирующий рост и развитие растений.
Известен консорциум молочнокислых, азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий, способствующий оздоровлению почвы и позволяющий повысить урожайность на 25-35%, приживаемость растений на 20-40% и качество стандартного посадочного материала (пат. РФ №2127509). Консорциум применяется для предпосевной обработки семян, для прямого внесения в грунт перед посевом или высадкой растений, для обработки вегетирующей части растений или внесения в почву в период роста. Однако отсутствуют данные о способности консорциума снижать численность патогенных микроорганизмов и разлагать растительные остатки в почве.
Известен консорциум азотофиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий Azospirillum sp. и антагониста Bacillus polymixa, способный к разложению целлюлозосодержащих материалов (солома, ксилан, гемицеллюлоза, лигнин) (пат. США №5147441 А). Однако свойства консорциума изучены только в лабораторных условиях, нет данных об эффективности его действия в полевых условиях.
Известны консорциумы бактерий Bacillus subtilis IC-1435-1-1, Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23, Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23, Bacillus licheniformis ВКПМ B-10561 (пат. РФ №2482174) и бактерий Bacillus licheniformis IC-831-1-2, Bacillus licheniformis IC-832-1-2, Bacillus licheniformis IC-833-1-2, Bacillus licheniformis IC-834-1-2 (пат. РФ 2440413) обладающие антибактериальной и фунгицидной активностью и обеспечивающие восстановление микробиоценоза почвы. Однако спектр антимикробной активности консорциума в отношении фитопатогенов сельскохозяйственных культур недостаточно широк.
Известен биопрепарат, состоящий из смеси суспензий следующих штаммов, депонированных в ВКПМ: Agrobacterium tumefaciens В-4116, Agrobacterium radiobacter В-956, Azotobacter chroococcum B-2375, Bacillus thurengiensis B-2918, Bacillus subtillis B-6554, Bacillus subtillis B-4419, Bacillus megaterium B-4440, Bacillus megaterium B-200, Bradyrhizobium japonicum B-1978, Ervinia ananas B-5292, Lactobacillus casei B-3961, Pseudomonas fluorescens B-1138, Rhodopseudomonas palustris B-1620. Изобретение позволяет восстановить плодородие почвы и улучшить ее структуру, увеличить всхожесть семян, укрепить иммунную систему растений, повысить сопротивляемость болезням и вредителям, что значительно увеличивает урожайность и качество получаемого продовольствия (пат. РФ №2322061). Однако способ получения препарата на основе 10-13 штаммов довольно трудоемкий: изначально штаммы бактерий выращивают раздельно в течение (36±2) часов при температуре 37°С на питательной среде, оптимальной для каждого штамма, смывают выросшие культуры 9% раствором хлорида натрия и рассчитывают по оптическому стандарту мутности (ОСО 45-28-59-85-П) количество микробных клеток в 1 мл суспензии, затем готовят суспензию каждого штамма в защитной среде, например в сахарозожелатиновой смеси, доводя концентрацию микробных клеток каждой культуры до 1,0-1,5×10 9 в 1 мл, после чего готовят смесь суспензий штаммов в определенном соотношении.
Известен препарат (пат. РФ №2313941) для защиты растений от возбудителей болезней сельскохозяйственных культур с ростостимулирующим эффектом, включающий культуральную жидкость штаммов микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве культуральной жидкости штаммов микроорганизмов он содержит культуральные жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis БАГ-65 и штамма актиномицета Streptomyces sindenensis БАГ-55, а также вспомогательные добавки.
Наиболее близким техническим решением является изобретение (пат. РФ №2482174), которое относится к биотехнологии и защите растений. Штамм бактерий Bacillus subtilis IC-1435-1-1 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10641. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10642. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23 депонирован в ВКПМ под регистрационным номером В-10643. Штаммы получены путем селекции и обеспечивают восстановление микробиоценозов почвы, обладают бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью. Препарат на основе штаммов содержит наполнитель или воду с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, или Bacillus amyloliquefaciens номером ВКПМ В-10642, или Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, или их смесью в соотношении 1:1:1 с титром каждого штамма бактерий не менее 1-10 4 КОЕ/г или 1·10 4 КОЕ/мл. Препарат обладает бактерицидной и фунгицидной активностью.
Однако данные штаммы также оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, препарат на их основе не обладает ростостимулирующей активностью, обладает недостаточно широким спектром антагонистической активности и способностью восстановления микробиоценоза почвы до эволюционно нормального. Предложенный биопрепарат не предусмотрен для использования в период вегетации растений и рекомендован только для внесения в почву.
Поставленная задача решается за счет использования препарата и следующих штаммов:
1. Штамм бактерий Bacillus. amyloliquefaciens 133, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11986.
2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens 67, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11987.
3. Штамм бактерий Pseudomonas brassicacearum S-1, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ B-11984.
4. Штамм бактерий Rahnella aquatilis Е 101, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11985.
5. Штамм бактерий Serratia plymuthica 53, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12008.
Технический результат, который может быть получен при использовании предлагаемых объектов, заключается в оздоровлении биоценоза, ускорении разложения лигноцеллюлозы, повышении урожайности сельскохозяйственных культур и качества получаемой продукции.
Культуры, составляющие смесь штаммов бактерий, выделены из почвы, а также из образцов, отобранных из компостных ям и из рубца домашней козы, идентифицированы с использованием микроскопических, биохимических, молекулярно-генетических методов исследования и переданы на хранение в ВКПМ под номерами: В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986, В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11987, P. brassicasearum ВКПМ В-11984, R. aquatilis ВКПМ В-11985, S. plymuthica ВКПМ В-12008.
Культурально-морфологические признаки штаммов, входящих в заявляемый состав
Вегетативные клетки В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11986 подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,8×1,2-1,5 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангиум не раздут.Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная.
Вегетативные клетки В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11987 подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,8×1,2-1,5 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная.
Клетки P. brassicasearum ВКПМ В-11984: прямые или слабо изогнутые палочки 0,6-0,7*1,3-2,3 мм, одиночные, в парах, реже в коротких цепочках. Грамотрицательные.
Клетки S. plymuthica ВКПМ В-12008 грамотрицательные прямые палочки, размером 0,5-0,8×0,9-2,0 мкм. Аспорогенны.
Клетки R. aquatilis ВКПМ В-11985 грамотрицательные палочки размером 0,3-0,4×0,6-1,2 мкм. Аспорогенны. Характер жгутикования перитрихальный.
Основным свойством смеси штаммов является наличие фитопротекторной, целлюлолитической и ростостимулирующей активностей.
Антимикробная активность установлена в отношении фитопатогенных грибов родов Fusarium, Alternaria, Botrytis, Sclerotinia, Rhizoctonia и фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia методом лунок на чашках Петри, при этом зоны подавления роста фитопатогенов составляют 18-27 мм в диаметре.
Смесь штаммов бактерий характеризуется продукцией гидролитических ферментов: эндо-1,4-β-глюканазы (0,8-1,5 ед/мл), ксиланазы (1,5-3,0 ед/мл), протеазы (10,0-12,0 ед/мл).
Штаммы-продуценты, входящие в состав препарата, являются непатогенными и безвредными для теплокровных животных, не обладают токсичностью, аллергенностью и токсигенными свойствами.
Пример 1. Получение препарата
Культуральные жидкости бактерий, содержащие живые бактериальные клетки, их споры и метаболиты, полученные при раздельном культивировании штаммов-продуцентов, смешивают в равных соотношениях (1:1:1:1:1).
Основные показатели готового препарата приведены в таблице 2.
Пример 2. Влияние препарата на целлюлолитическую активность почвы и степень разложения соломы и стерни в модельных и модельно-полевых условиях
В результате опыта по разложению соломы лучшие показатели получены в варианте с заявляемым препаратом, использование которого повышает разложение соломы в 4 раза по сравнению с контролем и в 2 раза по сравнению с эталоном.
На основании результатов исследований (см. таблицу 4) установлено, что применение препарата положительно влияет на увеличение темпов протекания деструкционных процессов, обеспечивая усиление степени минерализации соломы на 7% и стерни на 5% относительно контроля, при этом скорость минерализации достигает 0,32%/сут. и 0,46%/сут., что в 1,7 и 1,3 раза превышает аналогичный показатель по соломе и стерне в контроле.
Таким образом, установлена способность препарата повышать целлюлолитическую активность почвы и ускорять разложение соломы и стерни в лабораторных и модельно-полевых условиях.
Пример 3. Влияние препарата на микробиологическую активность почвы
Использование препарата для обработки почвы после запашки соломы стимулирует жизнедеятельность почвенных микроорганизмов, повышая биогенность почвы в 2,2 раза (44,86 млн. КОЕ/г) по сравнению с контролем (19,77 млн. КОЕ/г).
Одним из показателей интенсификации минерализационных процессов в почве может быть соотношение бактерий, усваивающих органический и минеральный азот. В почвах с более энергичным процессом минерализации микроорганизмы, усваивающие минеральный азот, обычно превышают по численности микрофлору, развивающуюся за счет органического азота. Нами установлено, что коэффициент минерализации при использовании заявляемого препарата в 2 раза превышает контрольные показатели, что аналогично действию эталона, коэффициент минерализации которого в 2,2 раза превышает контроль (таблица 5).
Таким образом, заявляемый препарат при внесении в почву, содержащую свежее органическое вещество, положительно влияет на увеличение общего микробного числа почвы и приводит к интенсификации минерализационных процессов.
Пример 4. Фитопротекторный и ростостимулирующий эффекты препарата при обработке семян сахарной свеклы, гибрид Портланд.
Заявляемый препарат снижает распространенность бактериозов на посевах сахарной свеклы до 56%, биологическая эффективность препарата составляет 44,4%, что несколько превышает показатели химического препарата «Кагатник» и практически в 2 раза превосходит биологический эталон.
Наряду с высоким фитопротекторным эффектом заявляемый препарат положительно влияет на густоту стояния сахарной свеклы, увеличивая ее до 56,3 тыс. шт./га, что на 39% выше, чем в контроле.
Кроме того, при использовании заявляемого препарата наблюдается улучшение качественных и количественных характеристик урожая сахарной свеклы. Так, под воздействием препарата происходит повышение сахаристости корнеплодов, что увеличивает сбор сахара с 1 га посевов на 4%, с 5,35 т в контроле до 5.56 т в обработанном варианте. Урожайность при этом возрастает на 13% по сравнению с контролем и на 4% по сравнению с химическим и биологическим эталонами.
Таким образом, заявляемый препарат оказывает высокий фитопротекторный эффект против бактериозов сахарной свеклы во время вегетации и улучшает качественные и количественные характеристики урожая.
Пример 5. Обеззараживание семян яровой пшеницы
Проведена оценка фунгицидной активности заявляемого препарата в отношении фитопатогенных грибов Bipolaris sp., Fusarium sp., Alternaria sp. и других возбудителей гнилей яровой пшеницы. Для этого семена яровой пшеницы с. Тулеевская обрабатывали из расчета 0,25 л препарата на 1 т семян. Исходная зараженность семян, установленная в лаборатории фитоиммунологии и защиты растений Курганского государственного университета (г. Курган), приведена в таблице 9. Лабораторные испытания показали, что обработка семян приводит к практически полному подавлению возбудителей фузариозно-гельминтоспориозной корневой гнили (Таблица 9).
Энергетическая оценка выращивания пшеницы в условиях обеззараживания семян биологическими препаратами приведена в таблице 10.
Таким образом, показан высокий фитопротекторный эффект заявляемого препарата при протравливании семян яровой пшеницы.
Пример 6. Обработка вегетирующих растений озимой пшеницы
Хозяйственная эффективность (сохраненный урожай в ц/га, в % к контролю и эталону) по вариантам представлена в таблице 12.
2. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11986, используемый для препарата по п.1.
3. Штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фитопротекторной активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11987, используемый для препарата по п.1.
4. Штамм бактерий Pseudomonas brassicacearum, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11984, используемый для препарата по п.1.
5. Штамм бактерий Rahnella aquatilis, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-11985, используемый для препарата по п.1.
6. Штамм бактерий Serratia plymuthica, обладающий ростостимулирующей активностью и депонированный во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-12008, используемый для препарата по п.1.