p16ink4a что это такое
P16ink4a что это такое
Иммуноцитохимическое исследование, позволяющее выявить экспрессию белка р16 (p16INK4a) на поверхности эпителиальных клеток. Белок р16 является биологическим маркером начала канцерогенеза – повышение его экспрессии наблюдается при предраковых изменениях и может рассматриваться как непрямой маркер активной онкогенной экспрессии ВПЧ высокого онкологического риска (выявляется при переходе ВПЧ из эписомальной формы в интегрированную). Определение экспрессии белка р16 позволяет с высокой точностью обнаружить риск развития рака шейки матки, своевременно поставить диагноз и назначить лечение. Определение уровня экспрессии позволяет выявить степень нарушения пролиферации, сопутствующей опухолевому росту, способность опухоли к инвазии и метастазированию.
Белок p16INK4a; иммуноцитохимическое исследование.
Синонимы английские
Оncoprotein p16INK4ain; immunocytochemical study.
Иммуноцитохимический метод + жидкостная цитология.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Аспират из полости матки.
Общая информация об исследовании
Было доказано, что экспрессия онкопротеина р16ink4a связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (по цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL), причем экспрессия онкопротеина р16ink4a не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В норме кодируемый геном-супрессором белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин-зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако при ВПЧ инфекции встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимической реакции.
В то же время, хотя отмечается четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имеется также большое количество ПЦР-позитивных по HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых при последующем гистологическом исследовании отсутствует предрак и рак. Это подтверждается негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4a в диспластических клетках.
Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки области шейки матки могут не попасть в препарат, подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно снижает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод жидкостной цитологии позволяет исключить эти негативные факторы. Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что при взятии материала можно получить до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований.
Данное обследование может быть применено в диагностике поражения шейки матки, где это является наиболее частым и востребованным методом исследования. Оно может позволить:
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Референсные значения: отсутствие экспрессии белка р16 в клетках эпителия (негативная реакция).
Заключение включает в себя два подраздела: цитологическое описание и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.
Цитологическое заключение интерпретируется в зависимости от выявления онкомаркера р16ink4a. В особенности это относится к дисплазиям шейки матки.
Белок р16(INK4a) осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, препятствуя пролиферации клетки. В норме по механизму обратной связи синтез р16 сдерживается, таким образом, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией.
Достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией, причем экспрессия р16 практически не встречается в плоском эпителии без признаков дисплазии (0-2% случаев).
Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии и выявляется:
Кто назначает исследование?
43 Определение предиктора изменений эндометрия PTEN, Ki67
30 Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]
P16ink4a что это такое
Риск рака шейки матки является вторым по частоте онкологическим заболеванием, угрожающим жизни женщины. Несмотря на достижения в диагностике, лечении и исследованиях этого заболевания, смертность в развивающихся странах продолжает оставаться высокой. Так, в 2008 году было зарегистрировано 529000 новых случаев и 275000 смертей от рака шейки матки. Прошло более 40 лет со времени открытия возбудителя этого заболевания. В 1970-х Harold zur Hausen предположил наличие корреляции между инфицированностью ВПЧ и развитием неопластических процессов в шейке матки. Вирус обладает высоким сродством к сквамозным эпителиальным клеткам и легко инфицирует их. Поражение вирусом, тем не менее, зависит от взаимодействия нескольких факторов: онкогенов, генов восстановления ДНК и генов-супрессоров опухоли [5].
Важное значение в профилактике рака шейки матки имеют диагностические программы обследования женщин. Заболеваемость раком шейки матки в мире колеблется в значительных пределах, и зависит во многом от экономической составляющей. Так, в США заболеваемость раком шейки невысока, в 2016 году 12990 женщин заболели и 4120 умерли от этого заболевания. Анализ показывает, что причиной этого является применение современных диагностических технологий, так женщинам в возрасте 21–29 лет раз в 3 года проводится анализ, предусматривающий гистологическую оценку методом жидкостной цитологии [6].
Применение Рар теста в гинекологической практике явилось фактором, поднявшим диагностику рака шейки матки на новый уровень. Вместе с тем, заболеваемость и смертность от рака шейки матки остается высокой, несмотря на контроль с помощью Рар теста, что указывает на ограниченные возможности этого диагностического метода. Частыми причинами ложных результатов анализа являются гиперплазия клеток, воспалительная атипия и сквамозная метаплазия. Наличие этих факторов приводит к необходимости повторных исследований или проведению более травматичных процедур [1]. Рак шейки матки вызывается 14 типами вируса папилломы человека (ВПЧ), а типы 16 и 18 являются причиной заболевания в 70 % случаев. Известно, что ВПЧ инфекция определяет развитие рака шейки матки, однако иммунная система в большинстве случаев обеспечивает элиминацию вируса в течение одного или двух лет [3, 4].
Современные программы скрининга основаны на жидкостной цитологии, включающей забор пробы маленькой пластиковой щеткой в питательную жидкую среду с целью дальнейшего приготовления мазков. Цервикальная цитология зависит от получения хороших образцов и экспертной интерпретации микроскопической картины, что практически не выполнимо без соответствующего оборудования и подготовки.
Весьма перспективным тестом диагностики дисплазии и рака шейки матки может быть иммуноцитохимическое определение повышенной экспрессии гена-супрессора p16INK4a. В норме, кодируемый этим геном, белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин- зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако, при ВПЧ инфекции, встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимическиой реакции [2]. Определение онкобелка p16INK4a позволяет вявить ранние стадии возникновения предрака и рака шейки матки. По эффективности этот тест является более релевантным, чем генотипирование ВПЧ или кольпоскопия.
Материалы и методы исследования
В сети медицинских клиник MedSwiss программой ДМС предусмотрено скрининговое исследование ранних пролиферативных процессов шейки матки. Эта программа включает:
1. Анализ данных жидкостной цитологии с поверхности шейки матки в режиме реального времени с применением компьютеризированной программы BD Focal Point и определение онкопротеина p16INK4a
2. ПЦР-тест на выявление основных 14 типов ВПЧ при первичном обследовании пациентки
3. Расширенное кольпоскопическое исследование на приеме у гинеколога.
В рамках этой программы при первичном осмотре у гинеколога пациенткам проводится Рар-тест в современной модификации, основанной на жидкостной цитологии. С этой целью одновременно из трех зон (поверхность шейки матки, из цервикального канала и зоны трансформации) берется биологический материал и помещается в виалу. Клеточный состав пробы обогащается, окрашивается на 2 стеклах и анализируется (на первом этапе одна проба) с помощью линейки приборов BD PreMate, BD SurePath, BD Focal Point.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования, степень дисплазии клеток, представляются по Цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и Цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL). В случае обнаружения патологических изменений проводится исследование второй пробы на экспрессию белка p16INK4a. Одновременно всем пациенткам проводится анализ на выявление ВПЧ методом ПЦР диагностики (14 типов вируса). Неотъемлемым компонентом первичного обследования гинеколога является расширенная кольпоскопия.
Важным компонентом алгоритма является интегрированная оценка анализа жидкостной цитологии, наличия ВПЧ в анализе ПЦР и данных кольпоскопии. Действительно, часто интегративный анализ всех трех компонентов- положительная ПЦР, результаты жидкостной цитологии и кольпоскопии является определяющими при дальнейшем обследовании и ведении таких пациенток. Так, при положительном анализе ПЦР диагностики на наличие вируса высокого онкогенного риска (типы 31, 33,35, 39,45,51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и особенно 16 и 18) и характерных изменениях данных жидкостной цитологии возможно отсутствие визуальных изменений при кольпокопии.
В зависимости от инфицированности ВПЧ, результатов цитологического исследования и наличия белка p16INK4a нами разработаны были дорожные карты ведения пациенток, предусматривающие схемы от наблюдения до медикаментозного лечения и хирургической деструкции шейки матки [4].
Заключение
Таким образом, применение теста на белок p16INK4a позволяет повысить и специфичность, и чувствительность диагностики при дисплазии шейки матки, обеспечивая адекватное ведение пациенток с этой патологией [7].
Тактика ведения пациенток с патологией шейки матки. Лечение – медикаментозные методы лечения. Сокращения: ИМТ – иммуномодулирующая терапия; ПВТ – противовирусная терапия; ХДШМ – хирургическая деструкция шейки матки; ЖЦ – жидкостная цитология
Онкомаркер p16ink4a
Определение онкомаркера p16ink4a с использованием жидкостной цитологии
Эффективный скрининг для выявления рака шейки матки требует достоверных методов исследования. Жидкостная цитология, в отличие от обычной, имеет преимущество, которое состоит в большей информативности. Для исследования используется не мазок на стекле, а сконцентрированная в результате отмывания и центрифугирования масса клеток эпителия.
На следующем этапе выявление с помощью цитохимического окрашивания белка-онкомаркера p16ink4a позволяет дифференцировать вид дисплазии – неопухолевую или онкогенную. Первая может быть следствием воспаления, а вторая имеет высокий риск злокачественного роста и требует соответствующего лечения.
Жидкостная цитология
Использование метода жидкостной цитологии дает возможность увеличить достоверность диагностики. Препарат для исследования представляет собой слой отмытых и сконцентрированных клеток, поэтому улучшаются возможности их визуализации под увеличением. В полученных препаратах на следующем этапе иммуноцитохимического исследования можно обнаружить любые белки, в том числе, маркеры онкологического роста.
Белок-онкомаркер p16ink4a
После проведенного лечения анализ имеет прогностическое значение.
Требования к забору материала
Забор, хранение и транспортировка материала для жидкостной цитологии требует тщательности и соблюдения определенных условий.
Наличие слизи в пробе может исказить результат, поэтому шейку матки от нее предварительно освобождают. Вращением специальной одноразовой щеточки в цервикальном канале забирают клетки эпителия, затем их переносят в контейнер с жидкостью для хранения и транспортировки.
Для предупреждения разрушения клеток пробу нельзя замораживать и хранить при комнатной температуре, должна соблюдаться температура от +4 до +8 градусов Цельсия.
Использование определения белка p16ink4a для диагностических целей актуально для женщин всех возрастных групп. Информативность метода жидкостной цитологии для оценки риска возникновения рака шейки матки делает его более предпочтительным.
Молекулярные антираковые механизмы способствуют старению
Для начала не повредит терминологическое уточнение. Существует обширное семейство генов, которые называют супрессорами злокачественных опухолей (в буквальном переводе, «угнетателями» или, точнее, «подавителями»), другое обозначение — антионкогены. Строго говоря, это наименование грешит неточностью, поскольку антираковое воздействие оказывают всё же не сами гены, а кодируемые ими белки. Однако оно давно вошло в употребление, так что пользоваться им можно, надо только не забывать, что конкретно оно означает.
Теперь перейдем от лингвистики к молекулярной биологии. Любой сложный организм, в том числе и человеческий, должен ремонтировать и обновлять свои ткани. Процессы такой починки и регенерации во многом обусловлены размножением (биологи говорят, пролиферацией) особого рода клеток, которые дают начало специализированным клеткам самых различных типов. Эти так называемые стволовые клетки, или клетки-предшественники, в последние годы получили такую известность, что вряд ли нуждаются в подробном представлении. С возрастом их способность к запуску процессов регенерации постепенно слабеет, что и служит причиной многих физиологических симптомов старения.
Однако пролиферация стволовых клеток — отнюдь не всегда благо. Она может зайти слишком далеко и привести к чрезмерному росту тех или иных тканей, который организму вовсе не нужен. Такой рост ведет ко множеству заболеваний, в том числе и к возникновению злокачественных опухолей. Организм борется с опасностью рака с помощью особых механизмов, которые либо вызывают генетически запрограммированную гибель клеток с раковым потенциалом (так называемый апоптоз), либо предотвращают их размножение. Часто такая блокировка осуществляется с помощью белков, которые лишают клетки способности нормально делиться. Это наводит на мысль, что только что описанные антираковые механизмы противодействуют «полезным» последствиям размножения клеток-предшественников, в том числе и замедлению старения.
Такое предположение действительно было высказано еще в прошлом десятилетии. Не могу отказать себе в удовольствии привести заголовок недавней (2003 год) статьи крупного американского специалиста по молекулярной геронтологии из Национальной лаборатории имени Лоуренса в Беркли Джудит Камписи (Judith Campisi), которая много занимается этими проблемами: «Рак и старение: демоны-соперники?» Новые публикации на сайте Nature как раз и свидетельствуют о том, что эта гипотеза вполне правдоподобна.
Эти интригующие факты выяснилось совсем недавно, в 2003-05 годы. А теперь обратимся к последним новостям. Сотрудники Центра всеобъемлющего изучения рака имени Лайнбергера при Университете Северной Каролины изучали активность гена p16 INK4a в островковых бета-клетках поджелудочной железы (естественно, не человеческих, а мышиных). Об этих клетках, наверное, многие слыхали хотя бы уже потому, что они производят инсулин (так что их гибель приводит к сахарному диабету первого рода, самой тяжелой форме этой малоприятной болезни).
Ученые во главе с Норманом Шарплессом (Norman Sharpless) обнаружили, что у нормальных мышей, доживших до 16-20 месяцев, этот ген включается гораздо чаще, нежели у их трех-четырехмесячных сородичей. Такой эффект был вполне ожидаем, но выяснились интересные подробности. Экспериментаторы сконструировали две линии генноинженерных мышей, атипичных по этому гену. У одной линии он попросту бездействовал, а у другой интенсивно включался, начиная с юного возраста. У животных первой группы островковые клетки в пожилом возрасте размножаются почти не хуже, чем в юности, а вот у вторых эти клетки с младых ногтей демонстрируют признаки одряхления.
Две другие группы получили аналогичные результаты, только на иных мышиных органах. Исследователи из Мичигана обнаружили, что усиленная экспрессия гена p16 INK4a ослабляет способность некоторых участков мозга формировать новые нейроны. Ученые из Гарварда пришли к выводу, что в пожилом возрасте этот ген снижает темпы пролиферации кроветворных стволовых клеток, «предков» зрелых клеток крови. Так что вывод всё тот же: белок p16 INK4a способствует старению самых разных стволовых клеток.
В чем же мораль сего рассказа? Ученые и раньше знали, что некоторые антионкогены способствуют клеточному старению (например, это делает p53, самый распространенный и потому знаменитый супрессор опухолей). Новые результаты показывают, что такая ситуация, скорее всего, достаточно типична. Таким образом, они подтверждают гипотезу, согласно которой молекулярные антиопухолевые механизмы способствуют возрастному одряхлению.
Здесь возникает весьма любопытная зависимость. Мыши с отключенным геном p16 INK4a стареют медленнее обычных, но, как это ни странно на первый взгляд, в общем не живут дольше, поскольку чаще заболевают раком. Так что на средство вечной молодости этот белок никак не тянет. Это верно и по другой причине: дефицит этого белка замедляет процессы старения отнюдь не универсально. Например, он препятствует снижению темпов размножения нейронов лишь некоторых, но отнюдь не всех участков головного мозга. Так что у старости много причин, в том числе и на молекулярном уровне.
Пока можно лишь с достаточным основанием утверждать, что белок p16 INK4a служит индикатором, биомаркером клеточного старения. Норман Шарплесс и его коллега Джанакираман Кришнамурти (Janakiraman Krishnamurthy) из Университета Северной Каролины в позапрошлом году подали патентную заявку на такое применение этого гена в биологии и медицине.
Источники:
1) Viktor Janzen et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a // Nature05159, 6 September 2006 (advance online publication).
2) Janakiraman Krishnamurthy et al. p16INK4a induces an age-dependent decline in islet regenerative potential // Nature05092, 6 September 2006 (advance online publication).
3) Anna V. Molofsky et al. Increasing p16INK4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing // Nature05091, 6 September 2006 (advance online publication).
P16ink4a что это такое
Синонимы английские
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Соскоб со слизистой прямой кишки.
Иммуноцитохимический метод + жидкостная цитология.
Как правильно подготовиться к исследованию?
Общая информация об исследовании
В большинстве случаев фактором риска развития рака является вирус папилломы человека 16-го и 18-го серотипов. Вирусы данных серотипов ответственны за 65-75% случаев возникновения рака шейки матки. Заражение вирусом папилломы человека происходит преимущественно половым путём. Хотя вирус достаточно быстро уничтожается иммунной системой, и, только если ему удаётся преодолеть иммунную защиту, развивается персистирующее течение заболевания, сопровождающееся изменениями в шейке матки.
В связи со стёртостью клинических проявлений и отсутствием специфической клиники наиболее эффективным методом диагностики являются регулярные гинекологические осмотры, призванные выявить ранние стадии злокачественных новообразований. Скрининговым методом, позволяющим выявить рак шейки матки на разных стадиях развития, является цитологическое исследование. Оно позволяет существенно снизить опасные и смертельные исходы заболевания.
Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки области шейки матки могут не попасть в препарат, подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно снижает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод жидкостной цитологии позволяет исключить эти негативные факторы. Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что при взятии материала можно получить до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований. Длительное время таким дополнительным методом было определение ДНК вируса папилломы человека высокого онкогенного риска. Однако в настоящее время известно, что скрининг ВПЧ-инфекции, осуществленный у женщин соответствующего возраста, может идентифицировать пациенток с низким риском развития рака шейки матки в случае негативного теста, но ПЦР ВПЧ бесполезна для обнаружения пациентов с высоким риском прогрессии.
Было доказано, что экспрессия онкопротеина р16ink4a связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (по цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL), причем экспрессия онкопротеина р16ink4a не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В норме кодируемый геном-супрессором белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин-зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако при ВПЧ-инфекции встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимической реакции.
В то же время, хотя отмечалась четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имелось также большое количество ПЦР-позитивных по HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых при последующем гистологическом исследовании отсутствовал предрак и рак. Данное явление подтверждалось негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4a + р53 в диспластических клетках.
Данное обследование может быть применено не только в диагностике поражения шейки матки, хотя это является наиболее частым и востребованным методом исследования. Оно широко распространено для диагностики и других видов онкологии, таких как рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы.
Таким образом, иммуноцитохимическое определение экспрессии онкопротеина р16ink4a + р53 в мазках, приготовленных при помощи жидкостной цитологии, может позволить:
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Интерпретация заключения проводится в зависимости от выявления онкомаркера р16ink4a и р53.
Для более эффективного выполнения данного скринингового исследования следует проводить целенаправленное обследование в группах риска.
Первый этап:
Соскоб со слизистой прямой кишки методом жидкостной цитологии + определение генотипов ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) методом ВПЧ DIGINE-тест.
Второй этап:
Определение онкопротеинов р16ink4a и р53 в качестве уточняющих тестов к первому этапу для определения потенциала дисплазии эпителия (рекомендуется в случае выявления интраэпителиальных изменений).
Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии.
В нормально функционирующих клетках концентрация белка р16 чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией. Белок практически не выявляется в случае отсутствия дисплазии (0-2% случаев).
Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии и выявляется:
Кто назначает исследование?
Гинеколог, уролог, онколог, терапевт, хирург, врач общей практики.