nucleic acid amplification test что это такое

3 вида тестов на коронавирус: преимущества и различия

Статья размещена: 6 Ноября 2021

Последнее изменение: 05 Октября 2020

Быстрая и надежная диагностика Covid-19 – это первый шаг к его лечению и профилактике. Чтобы определить наличие вируса в организме, применяются разные методы исследования. К ним относится экспресс-тестирование на антитела, методика ПЦР и LAMP. Здесь всего за несколько минут вы сможете узнать, какой из этих тестов более эффективный, как они проводятся и сколько занимают по времени.

ПЦР-тест

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является более точным способом выявления инфекции Covid-19. В отличие от других способов диагностики он направлен не на обнаружение антител, вырабатываемых организмом при заболевании, а непосредственно на сам вирус. Это позволяет определить, болеет человек коронавирусной инфекцией в настоящий момент или нет. ПЦР-тест наиболее эффективен в том случае, если он сделан в течение 7-10 дней с возникновения первых симптомов инфекционного заболевания.

Как проводится тест ПЦР? Забор биоматериала из носоглотки для исследования производится при помощи тампона. Для этого необходимо обратиться в лабораторию или вызвать специалистов частной клиники на дом (например, если вы не хотите контактировать с другими людьми).

Кому рекомендуется тестирование ПЦР? Если вы контактировали с человеком, болеющим Covid-19.

Через сколько будут известны результаты исследования? В среднем, для получения результатов необходимо около 24 часов. При обращении в государственные лаборатории срок ожидания может увеличиться до 2-3 дней и более.

Насколько точно тестирование ПЦР? Это самый надежный метод выявления Covid-19. По данным исследований, клиническая чувствительность тестов составляет около 80%, поэтому получение ложноотрицательного или ложноположительного результата сведено к минимуму.

Тест на антитела к Covid-19

При проникновении вируса в организм иммунная система начинает вырабатывать специфические антитела (Ig – иммуноглобулины), предназначенные для защиты от инфекции. Тесты на антитела к Covid-19 определяют их наличие и поэтому позволяют узнать, болеет человек коронавирусом или уже переболел ранее.

Всего в организме человек существует 5 видов антител: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE. В основном, при коронавирусной инфекции вырабатываются:

Для тестирования на антитела применяется иммуноферментный (ИФА) либо иммунохемилюминесцентный (ИФЛА) анализ. Это экспресс-тестирование, показывающее количество антител IgM и IgG. Проводится в лаборатории или в домашних условиях, если вызвать специалистов частной клиники для забора биоматериала на дом.

Как проводится скрининг? Применяется образец крови, взятой из вены или пальца. Биоматериал и специальный раствор наносится на тест-карту. Результат определяется после полного проявления цветных полос, количество и расположение которых указывает на наличие иммуноглобулинов.

Кому рекомендуется экспресс-тестирование? Министерство здравоохранения России рекомендует пройти тест ИФА:

Через сколько будут известны результаты исследования? В течение 10-15 минут. Скорость – это главное преимущество исследований на антитела, поэтому методы ИФА и ИФЛА остаются одними из самых популярных при диагностике коронавирусной инфекции.

Насколько точно исследование на антитела? Точность методов ИФА и ИФЛА достигает 60-65%. Чаще всего получение ложноотрицательного или ложноположительного результата связано с неправильным забором биоматериала, поэтому обращайтесь только к профессионалам.

Метод LAMP

Метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) считается «упрощенной» версией исследования ПЦР. Относится к тест-системам, при этом производители настаивают на том, что их точность составляет 94%. Методика LAMP также основана на том, что РНК вируса достраивается до ДНК, а затем происходит копирование при постоянной температуре 65 °C. Исследование проводится в лабораторных исследованиях.

Как проводится LAMP? Чтобы определить Covid-19 этим методом, происходит забор биоматериала из носоглотки. Затем для получения точного результата к нему добавляются праймеры (фрагмент нуклеиновой кислоты) и состав исследуется в лабораторных условиях.

Кому рекомендуется диагностика LAMP? Тем, кто контактировал с лицами, больными Covid-19, а также людям, входящим в группу риска (например, пожилым людям и тем, у кого имеются тяжелые хронические заболевания).

Через сколько будут известны результаты? В течение 20-40 минут. Метод LAMP на данный момент не применяется в государственных лабораториях. Однако его используют в частных клиниках для подтверждения результатов экспресс-тестирования.

Насколько точно исследование LAMP? Данные об эффективности этого метода диагностики отсутствуют. Однако, по мнению многих специалистов, его точность схода с методикой полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Какой способ диагностики лучше?

Все методы, применяемые для выявления Covid-19, успешно применяются в диагностике заболевания. Они отличаются по методу и показаниям к проведению, а также по длительности получения результатов. Однако применяются в разных случаях, поэтому имеют равную эффективность.

Если вы находитесь в тесном контакте с человеком, болеющим коронавирусом, рекомендуется ПЦР-исследование. В отличие от остальных методик оно занимает больше времени, но позволяет получить максимально точные данные.

Если вы хотите узнать, переболели ли уже Covid-19, рекомендуется экспресс-тест на антитела. Он занимает минимум времени и позволяет узнать, на какой стадии развития находится заболевание, и переболели ли вы им раннее (например, если коронавирус прошел в бессимптомной форме).

Если вы входите в группу риска заражения Covid-19, рекомендуется экспресс-тест на антитела или исследование LAMP. Обе методики быстро проводятся и имеют сравнительно высокую эффективность, поэтому вероятность получения ложного результата минимальна.

Полезные рекомендации

Самое важное – это выбрать лабораторию. Обращайтесь только в надежные места, чтобы быть уверенным в точности диагностики. В 2020 году исследования проводят как государственные лаборатории, так и частные клиники. В последнем случае вы можете вызвать специалистов для забора биоматериала на дом и гораздо быстрее получите результаты

Следующий нюанс – это момент сбора биоматериала. Если он будет проведен неправильно, то возрастет риск получения ложного положительного или ложного отрицательного результата. Чтобы этого избежать, необходимо соблюдать некоторые правила:

Если результаты оказались положительными, то не паникуйте. Своевременное обнаружение Covid-19 обеспечивает быстрое лечение. При обращении в частные клиники оно разрабатывается индивидуально, поэтому позволяет быстро побороть вирус и избежать дальнейшего развития инфекции.

Источник

Достижения

Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорной точкой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.

В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент идеально дополняет целевую последовательность. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Стандартная разность свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами для замены опоры на пальцах ног с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним значением. 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и с концентрациями нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.

После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которых также используется реакция обмена пальцами ног. Это позволило оптическое обнаружение правильной цели и цели SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.

В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции». В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, минимум 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.

Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). Это термостойкая ПЦР, которая избирательно усиливает все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, позволяя легко обнаруживать и количественно оценивать сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.

Источник

Методы тестирования на COVID-19 и их ограничения — отчет ECDC

European Centre for Disease Prevention and Control: COVID-19 testing strategies and objectives. 15 September 2020. ECDC: Stockholm, 2020

Лица из ECDC, которые участвовали в написании этого документа (в алфавитном порядке): Cornelia Adlhoch, Eeva Broberg, Bruno Ciancio, Lisa Ferland, Tjede Funk, Irina Jovel Quinonez Dalmau, Pete Kinross, Katrin Leitmeyer, Angeliki Melidou, Lina Nerlander, Anastasia Pharris, Diamantis Plachouras, Gianfranco Spiteri, Carl Suetens, Ivo Van Walle

Консультация: Weronika Rymer, Agnieszka Wroczyńska, Bogdan Solnica, Anna Mertas, Jerzy Jaroszewicz

Сокращения: ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения, ЕС — Европейский союз, ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, COVID‑19 (coronavirus disease) — заболевание, вызываемое SARS-CoV-2, ECDC – European Centre for Disease Prevention and Control, NAAT (nucleic acid amplification tests) — амплификационное тестирование нуклеиновых кислот, POCT (point-of-care testing) — тестирование в месте оказания медицинской помощи, SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) — коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2

Период инкубации

Еще две важные характеристики тестов — это скорость и простота выполнения. Технические спецификации медицинских устройств для диагностики in vitro (Решение Комиссии 2002/364/EC) 5 определяют быстрые тесты как тесты, которые «могут выполняться только на отдельных образцах или небольшими партиями и предназначены для быстрого получения результата при проведении в непосредственной близости от пациента». Согласно подготовленному ВОЗ первоначальному профилю тестов, проводимых в месте оказания помощи пациентам (POCT — тесты, которые можно проводить непосредственно при пациенте, например, дома, рядом с больничной койкой, в кабинете врача — прим. ред.), для людей с подозрением на COVID- 19 и контактных лиц, такой тест должен соответствовать следующим требованиям: 6

1. целевые условия выполнения

a) допустимые — тест может проводиться вне лаборатории, как в постоянных, так и в специальных пунктах сегрегации/скрининга, проводимых в медицинских учреждениях, например, в отделениях неотложной помощи больниц, в мобильных подразделениях и вне медицинских учреждений (мониторинг контактных лиц) медицинским персоналом или лаборантами, прошедшими соответствующую подготовку по забору проб материала, биобезопасности и проведению исследований

б) желаемые — такие же, как и допустимые; кроме того, тест может проводиться обученным немедицинским персоналом (волонтерами/общественными работниками);

2. время ожидания результата:

а) допустимое ≤40 минут

б) желаемое ≤20 минут.

Алгоритмы проведения исследований

Чтобы упростить процесс тестирования и повысить его эффективность, помимо однократного анализа одной пробы, можно использовать комбинацию нескольких тестов (то есть алгоритм тестирования). Следующие 3 алгоритма наиболее полезны.

Быстрый тест (экспресс-тест) с последующим проведением подтверждающего теста с тем же образцом

Цель экспресс-теста — эффективно выявить высокий процент заражений и без промедления принять соответствующие меры контроля. Такой тест должен быть очень специфичным, чтобы избежать ложноположительных результатов, но на практике он обычно характеризуется низкой чувствительностью. Таким образом, существует высокая вероятность того, что отрицательный результат экспресс-теста будет ложноотрицательным, в то время как положительный результат скорее всего будет истинно положительным. Затем может быть проведен подтверждающий тест с высокой чувствительностью и высокой специфичностью — обычно это молекулярный тест, который не является экспресс-тестом и выполняется в лаборатории — с использованием образцов, результаты исследования которых с помощью экспресс-теста были отрицательными, для выявления дополнительных случаев инфицирования. Положительный результат экспресс-теста, согласно определению случая, требует подтверждения с помощью ОТ-ПЦР.

Групповое тестирование образцов

Групповое тестирование (пулирование) образцов является более быстрым методом, чем анализ отдельных образцов, а также экономит ресурсы в ситуациях, когда ожидаемый процент положительных результатов очень низок (≤5 %). 7, 8 Метод заключается в объединении большего количества образцов с сохранением части материала или второго образца от каждого исследуемого. Частота получения положительного результата группового исследования зависит от эпидемиологической ситуации. Если получен такой результат, образцы следует тестировать индивидуально.

В качестве альтернативы образцы могут быть помещены в несколько пулов, результаты которых вместе определяют положительный образец.

Продолжение исследований и время проведения тестирования

Под продолжением тестирования мы подразумеваем выполнение более одного теста в разное время у данного человека, чтобы повысить вероятность обнаружения инфекции. Основная цель такого алгоритма тестирования — выявить случаи бессимптомных и предсимптомных инфекций. Положительный результат не будет получен сразу после заражения, а только после достаточной репликации вируса, когда в собранном образце присутствует достаточное количество РНК или антигена SARS-CoV-2. Также важен предел обнаружения используемого теста. Однако в некоторых ситуациях невозможно определить, прошло ли достаточное время с момента заражения, чтобы определить вирус с помощью выбранного теста. Это может быть связано с тем, что инкубационный период варьируется от у различных лиц, или с отсутствием информации о том, когда произошло воздействие. Чем раньше обнаружена инфекция, тем выше вероятность предотвращения дальнейшей передачи (например, путем мониторинга контактных лиц). Поэтому дальнейшее тестирование выполняется из-за риска получения отрицательного результата первого теста, если он выполняется на стадии заражения, когда вирус еще не может быть обнаружен с помощью данного теста, особенно если это экспресс-тест с более высоким пределом обнаружения.

Как показано на графике средней продолжительности контагиозности (см. рисунок), определяемой как процент возможных передач инфекции, примерно за 4 дня до появления симптомов наблюдается ее резкое увеличение, что увеличивает виремию и обнаружение вируса. 9,10 Однако обнаружено, что тест ОТ-ПЦР во время инкубационного периода может выявить вирусную РНК за 1–3 дня до появления симптомов. 9,11,12

Поскольку в подавляющем большинстве случаев инкубационный период составляет ≤12 дней (см. «Инкубационный период» выше), обычно от заражения до обнаружения вируса проходит несколько дней. Следовательно, у бессимптомных или предсимптомных людей, когда не известно, когда произошел контакт с патогеном или информация об этом недостоверна, проверка первого теста с отрицательным результатом в одном или нескольких последующих тестах может значительно повысить эффективность выявления инфицированных людей. Поскольку в большинстве случаев инкубационный период заболевания составляет 12 дней, а вирус обнаруживается за 1–3 дня до появления симптомов, мы оцениваем на основе имеющихся в настоящее время данных, что тест, проведенный примерно на 10-й день после возможного контакта с вирусом, позволяет выявить большинство случаев инфекции, вызванной SARS-CoV-2. ECDC постоянно анализирует данные по мере их поступления и проводит собственные модельные анализы в этом отношении, поэтому эта оценка может измениться по мере появления новой информации.

Типы образцов

Образцы для диагностического тестирования на наличие SARS-CoV-2 можно получить из верхних отделов (мазки из носоглотки или ротоглотки, назальный аспират, промывные воды из носа, слюна) или нижних дыхательных путей (мокрота, трахеальный аспират или бронхоальвеолярная лаважная жидкость). Сравнение точности тестов ОТ-ПЦР для этих материалов указывает на возможные различия в пределах количественного определения теста в зависимости от типа образца. Считается, что мазки из носоглотки и ротоглотки обеспечивают соответствующий предел количественного определения для тестирования SARS-CoV-2, причем было обнаружено, что тестирование с образцами материала и из носоглотки и из ротоглотки обеспечивает более высокий предел количественного определения, чем те, которые сделаны с использованием мазка только из носоглотки. 11,14,15 Если нельзя получить мазки из носоглотки или другой материал из верхних дыхательных путей (как указано выше), допускается забор слюны. 16, 17 Это происходит неинвазивным способом, поэтому можно рассмотреть возможность самостоятельного забора пациентом.

1. Li Q., Guan X., Wu P. и соавт.: Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia. N. Engl. J. Med., 2020; 382: 1199–1207

2. Lauer S.A., Grantz K.H., Bi Q. и соавт.: The incubation period of coronavirus disease 2019 (COVID-19) from publicly reported confirmed cases: estimation and application. Ann. Intern. Med., 2020; 172: 577–582

3. World Health Organization (WHO): Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases: interim guidance. 19.03.2020. https://apps.who.int/iris/ handle/10665/331501

4. Kellam P., Barclay W.: The dynamics of humoral immune responses following SARS-CoV-2 infection and the potential for reinfection. J. Gen. Virol., 2020; 101: 791–797

5. European Commission (EC): 2002/364/EC: Commission Decision of 7 May 2002 on common technical specifications for in vitro-diagnostic medical devices (Text with EEA relevance) (notified under document number C(2002) 1344). 2002. https://eurlex.europa. eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32002D0364

6. WHO: COVID-19 Target product profiles for priority diagnostics to support response to the COVID-19 pandemic v.0.1. 5.08.2020. www.who.int/publications/m/item/covid-19-target-product-profiles-for-priority-diagnostics-to-support-response-to-the-covid-19-pandemic-v. 0.1

7. ECDC: Infection prevention and control and surveillance for coronavirus disease (COVID-19) in prisons in EU/EEA countries and the UK. 3.07.2020. www.ecdc.europa.eu/ en/publications-data/infection-prevention-and-control-and-surveillance-covid-19-prisons

8. Shental N., Levy S., Wuvshet V. и соавт.: Efficient high-throughput SARS-CoV-2 testing to detect asymptomatic carriers. Science Adv., 2020: eabc5961

9. He X., Lau E.H.Y., Wu P. и соавт.: Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med., 2020; 26: 672–675

10. He X., Lau E.H.Y., Wu P. и соавт.: Author correction: temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med., 2020; 26: 1491–1493

11. Pan Y., Zhang D., Yang P. и соавт.: Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples. Lancet Infect. Dis., 2020; 20: 411–412

12. Wei W.E., Li Z., Chiew C.J. и соавт.: Presymptomatic transmission of SARS-CoV-2 – Singapore, January 23–March 16, 2020. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep., 2020; 69: 411–415

13. ECDC: Guidance for discharge and ending isolation In the context of widespread community transmission of COVID-19 – first update. 8.04.2020. www.ecdc.europa.eu/en/ publications-data/covid-19-guidance-discharge-and-ending-isolation

14. Yan Y., Chang L., Wang L.: Laboratory testing of SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2 (2019-nCoV): current status, challenges, and countermeasures. Rev. Med. Virol., 2020; 30: e2106

15. Mawaddah A., Gendeh H.S., Lum S.G., Marina M.B.: Upper respiratory tract sampling in COVID-19. Malays J. Pathol., 2020; 42: 23–35

16. Yang Y., Yang M., Shen C. и соавт.: Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infections. medRxiv, 2020.02.11.20021493

Источник

Современные молекулярно-генетические технологии в диагностике вирусных заболеваний

*Пятилетний импакт фактор РИНЦ за 2020 г.

Читайте в новом номере

Высокая контагиозность и стремительное распространение вирусных инфекций обусловливают важность своевременной постановки точного клинического диагноза заболевания. На сегодняшний день существует необходимость получать всесторонние знания о происхождении, путях распространения и эволюции возбудителей вирусных инфекций для дальнейшего прогнозирования и предупреждения заболеваний. Благодаря внедрению передовых молекулярно-генетических методов это стало возможным. С целью создания доступных, точных и быстрых методов для выявления вирусных патогенов лабораториями во всем мире успешно разрабатываются и производятся крайне необходимые тестовые наборы для скринингового выявления инфекции, т. к. именно бессимптомные случаи способствуют ее дальнейшему распространению. За последний год активная разработка диагностических наборов для выявления вируса SARS-CoV-2, являющегося возбудителем новой коронавирусной инфекции (COVID-19), способствовала совершенствованию молекулярно-генетических методов, особенно для тестирования в местах оказания помощи, при массовых и скрининговых исследованиях. Активно применяется метод ОТ-ПЦР при детекции вирусной РНК, тогда как другие исследования нуклеиновых кислот, такие как изотермическая ПЦР, анализы на гибридизационных микрочипах, метагеномное секвенирование на основе ампликонов и передовые технологии, связанные с CRISPR, все еще находятся в стадии внедрения в практическое здравоохранение.

Ключевые слова: вирусы, диагностика, молекулярно-генетические методы, полимеразно-цепная реакция, РНК.

Для цитирования: Арнаудова К.Ш., Ясенявская А.Л., Ростошвили Г.А. и др. Современные молекулярно-генетические технологии в диагностике вирусных заболеваний. РМЖ. Медицинское обозрение. 2021;5(7):497-502. DOI: 10.32364/2587-6821-2021-5-7-497-502.

K.Sh. Arnaudova, A.L. Yasenyavskaya, G.A. Rostoshvili, M.A. Samotrueva, O.A. Bashkina

Astrakhan State Medical University, Astrakhan, Russian Federation

High contagiousness and rapid spread of viral infections highlight the importance of their timely clinical diagnosis. There is a current need to gain in-depth knowledge of viral agents’ origin, routes, and evolution to predict and prevent viral diseases. The introduction of advanced molecular genetic testing made this possible. Laboratories worldwide develop and manufacture urgently needed test kits for rapidly detecting infections since asymptomatic cases favor further dissemination of these diseases. Over the last year, the active development of diagnostic kits for COVID-19 contributed to the improvement of molecular genetic testing, particularly for mass and screening testing. RT-PCR is widely applied to detect viral RNA. Meanwhile, other tests for nucleic acids, e.g., isothermal amplification, microarray hybridization, amplicon metagenome sequencing, and CRISPR, are now introduced into daily practice.

Keywords: viruses, diagnostics, molecular genetic testing, po lymerase chain reaction, RNA.

For citation: Arnaudova K.Sh., Yasenyavskaya A.L., Rostoshvili G.A. et al. State-of-the-art molecular genetic testing for the diagnosis of viral infections. Russian Medical Inquiry. 2021;5(7):497–502 (in Russ.). DOI: 10.32364/2587-6821-2021-5-7-497-502.

Введение

Начало XXI в. ознаменовалось появлением ряда потенциально опасных для человека вирусов [1], сопровождающихся высокой летальностью и являющихся глобальной проблемой для здравоохранения [2]. Так, за последние 20 лет выявлено 3 новых вируса, относящихся к семейству коронавирусов, а именно вирусы тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) и новая коронавирусная инфекция COVID-19 (SARS-CoV-2) [3].

Известно, что коронавирусы (CoV) — это одноцепочечные РНК-содержащие вирусы, относящиеся к подсемейству Coronavirinae, семейству Coronaviridae, отряду Nidovirales [5]. CoV легко мутируют, что дает им возможность быстро адаптироваться к новым условиям [6]. Эволюция возбудителя была не только следствием филогении, но и результатом взаимодействия между вирусом и хозяином [7].

До эпидемии атипичной пневмонии было известно около 10 CoV с полными последовательностями генома, разделенные на три группы, но в 2011 г. Международным комитетом по таксономии вирусов группы переименовали в три рода: Alphacoronavirus, Betacoronavirus и Gammacoronavirus [8]. Филогенетический анализ генома SARS-CoV определил уникальное положение в роде β-коронавирусов, который впоследствии был помещен в подрод Sarbecovirus. Типичные представители β-коронавирусов (например, вирус гепатита мыши, CoV OC43 человека, CoV крупного рогатого скота) были классифицированы как Embecovirus. После эпидемии SARS было обнаружено беспрецедентное количество новых CoV [9, 10]. Это привело к описанию линии C Betacoronavirus, которая включает коронавирусы летучих мышей (Tylonycteris HKU4, Pipistrellus HKU5, Hypsugo HKU25) и вирус, вызывающий ближневосточный респираторный синдром CoV [11], а также линии D Betacoronavirus [12] и новый род Deltacoronavirus [13, 14]. Затем линия C и линия D Betacoronavirus были переименованы в подроды Merbecovirus и Nobecovirus.

На сегодняшний день установлено, что 7 видов CoV передаются от человека к человеку. Среди них HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43 и HCoV-229E, вызывающие заболевания верхних дыхательных путей [15–19]. С 1960-х годов были хорошо известны HCoV-OC43 и HCoV-229E. Впоследствии SARS-CoV, HCoV-NL63 и HCoV-HKU1 детектировались в 2003, 2004 и 2005 гг. соответственно [20–22]. MERS-CoV, выделенный в 2012 г., аналогичен SARS-CoV. Вирусы MERS-CoV и SARS-CoV поражают в большей степени нижние дыхательные пути и потенциально могут вызвать острый респираторный синдром.

В декабре 2019 г. в Китае выявлена новая коронавирусная инфекция у пациентов с пневмонией [20]. 7 января 2020 г. ВОЗ представила данный коронавирус как 2019-nCoV, позднее вирус был переименован в SARS-CoV-2 [23]. Заболевание сопровождается поражением, прежде всего, легочной ткани и, как правило, у лиц пожилого возраста и с сопутствующими заболеваниями с тяжелым течением, что приводит к полиорганной недостаточности, острому респираторному дистресс-синдрому, поражению желудочно-кишечного тракта и пневмонии [24, 25]. По состоянию на январь 2021 г. количество заболевших COVID-19 по всему миру достигло 92,3 млн человек, летальных исходов — 1,97 млн. Количество проводимых тестов на выявление SARS-CoV-2 в России существенно возросло с начала 2020 г. На июнь 2021 г. проведено более 100 млн тестов на выявление новой коронавирусной инфекции [26].

Диагностика вирусных заболеваний

Высокая контагиозность и стремительное распространение вирусных инфекций обусловливают важность свое­временной постановки точного клинического диагноза заболевания. На сегодняшний день существует необходимость получать данные о происхождении [27, 28], путях распространения [29] и эволюции возбудителей для дальнейшего прогнозирования и предупреждения заболевания [30, 31]. Благодаря внедрению передовых молекулярно-генетических методов это стало возможным [32].

С целью создания доступных, точных и быстрых методов для выявления SARS-CoV-2 лабораториями по всему миру успешно разрабатываются и производятся крайне необходимые тестовые наборы для скринингового выявления инфекции, т. к. именно бессимптомные случаи способствуют ее дальнейшему распространению.

Современные коммерчески доступные тесты на COVID-19 основаны на молекулярных анализах для обнаружения вирусной РНК SARS-CoV-2 с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации нуклеиновых кислот.

Методы молекулярной диагностики, основным критерием эффективности которых является высокая чувствительность, позволяют избежать ложноотрицательных результатов и используются для постановки диагноза, а также для выявления бессимптомных форм и носительства SARS-CoV-2. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) считается «золотым стандартом» для идентификации вируса SARS-CoV-2 [33]. ОТ-ПЦР основана на способности амплифицировать небольшое количество генетического вирусного материала в образце. В качестве стандартного исследуемого материала используют мазки, взятые из верхних дыхательных путей. Кроме того, было проведено несколько исследований с использованием сыворотки крови, кала, слезной жидкости и слюны [34]. ОТ-ПЦР начинается с преобразования вирусной геномной РНК в ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). В этой реакции используются праймеры (синтетические олигонуклеотиды) для последовательностей ДНК, предназначенные для специфического распознавания комплементарных последовательностей в вирусном геноме РНК и обратной транскриптазы с целью создания короткой комплементарной ДНК-копии (кДНК) вирусной РНК. В ОТ-ПЦР амплификация ДНК отслеживается в реальном времени по мере развития реакции с использованием флуоресцентного красителя или ДНК-зонда, специфичного для последовательности, меченного флуоресцентной молекулой и молекулой гасителя [35]. ОТ-ПЦР проводится как одно- и как двухэтапная процедура. В одноэтапной ОТ-ПЦР в реальном времени используется одна пробирка, содержащая необходимые праймеры для проведения всей реакции ОТ-ПЦР. Двухэтапная ОТ-ПЦР в реальном времени включает более одной пробирки для проведения отдельных реакций обратной транскрипции и амплификации, но обеспечивает более высокую чувствительность и требует меньшего исходного материала, чем одноэтапная процедура, а также позволяет хранить кДНК для количественной оценки нескольких мишеней. Несмотря на это, одноэтапная процедура является предпочтительным методом для обнаружения SARS-CoV-2 благодаря сокращению времени на лабораторное тестирование, что снижает вероятность ошибок при дозировании и контаминации на этапах ПЦР в реальном времени.

В большинстве молекулярных диагностических тестов используется технология ОТ-ПЦР в реальном времени, нацеленная на различные области генома SARS-CoV-2, включая области ORF1b или ORF8, а также нуклеокапсид (N), белок-шип (S), РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRP) или гены оболочки (E) [36].

Тесты ОТ-ПЦР постоянно совершенствуются и автоматизируются. Например, в тесте ePlex SARS-CoV-2, разработанном GenMark Diagnostics, Inc. [37], для обнаружения SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки используется прибор ePlex. Каждый тестовый картридж содержит реагенты для магнитной твердофазной экстракции вирусной РНК, амплификации кДНК и детекции, сочетающие электросмачивание и технологию GenMark eSensor. ДНК-мишень смешивается с сигнальными зондами, меченными ферроценом, комплементарными конкретным мишеням. Целевая ДНК гибридизируется с сигнальным и захватывающим зондами, которые связаны с позолоченными электродами. Присутствие мишени определяется с помощью вольтамперометрии, которая генерирует определенные электрические сигналы от сигнального зонда.

Несмотря на широкое применение ОТ-ПЦР для детекции SARS-CoV-2, метод имеет ряд ограничений: длительность анализа, необходимость наличия дорогостоящего лабораторного оборудования и высококвалифицированного персонала. В связи с этим существует необходимость совершенствования этого метода и разработки других методов идентификации.

Одним из таких альтернативных методов является изотермическая амплификация нуклеиновых кислот. В отличие от метода ОТ-ПЦР, требующего многократных изменений температуры для каждого цикла с использованием сложного оборудования для термоциклирования [37], изотермическая амплификация проводится при постоянной температуре, таким образом, устраняется необходимость в термоциклере.

Изотермическая амплификация, опосредованная обратной транскрипцией (RT-LAMP), является быстрым и экономически выгодным методом для тестирования на SARS-CoV-2. Для RT-LAMP требуется набор из четырех праймеров, специфичных для целевого гена/области, что повышает чувствительность теста, и сочетает LAMP с этапом обратной транскрипции для обнаружения РНК. Продукт амплификации может быть обнаружен с помощью фотометрии, измерения мутности, вызванной осадком пирофосфата магния в растворе в качестве побочного продукта амплификации. За реакцией также можно следить в реальном времени путем измерения флуоресценции с использованием интеркалирующих красителей. Поскольку для диагностического тестирования RT-LAMP в реальном времени требуется только нагревание и визуальный осмотр, его простота и чувствительность делают его много­обещающим методом для обнаружения вирусов.

Некоторые из доступных в настоящее время молекулярных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 используют технологию RT-LAMP в реальном времени, например тест ID NOW COVID-19 от Abbott Diagnostics. Этот тест можно проводить у постели больного, он является быстрым (≤13 мин) и используется для обнаружения вирусной РНК SARS-CoV-2 в мазках из верхних дыхательных путей, но ограничен использованием только одного образца за цикл [38]. Тест RT-LAMP, разработанный Zhang et al. [39], основан на применении обратной транскриптазы (WarmStart RTx от BioLabs) для преобразования вирусной РНК в кДНК, которая впоследствии амплифицируется ДНК-полимеразой (Bst2.0 Warmstart), для колориметрического обнаружения с помощью ДНК-связывающего красителя (SYTO-9, ThermoFisher). Фермент представляет собой уникальную in silico РНК-направленную ДНК-полимеразу, связанную с обратимо связанным аптамером, который ингибирует активность RTx при температуре ниже 40 °C. Было показано, что колориметрический LAMP эффективен при обнаружении вирусной РНК в клеточных лизатах на уровне примерно 480 копий РНК, обеспечивая альтернативу ОТ-ПЦР для быстрого и простого обнаружения РНК SARS-CoV-2.

Современные молекулярно-генетические тесты

К числу внедряемых в практику молекулярно-генетических методов относится опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА), являющаяся запатентованной технологией изотермической амплификации с одной пробиркой. ТМА смоделирована на основе репликации ретровирусов, которую можно использовать для амплификации определенных участков РНК или ДНК, и имеет более высокую чувствительность, чем ОТ-ПЦР. В методе используют обратную транскриптазу и РНК-полимеразу Т7. На основе данного метода разработана платформа Hologic Panther Fusion, на которой возможно проводить как ОТ-ПЦР, так и ТМА; она отличается высокой пропускной способностью (до 1000 тестов за 24 ч) и возможностью одновременного скрининга на другие распространенные респираторные вирусы, клинически схожие с COVID-19. На начальной стадии происходит гибридизация вирусной РНК-мишени со специфическим улавливающим зондом и дополнительным олигонуклеотидом, содержащим промоторный праймер Т7, которые захватываются магнитными микрочастицами при воздействии магнитного поля. Затем захваченная РНК-мишень, гибридизованная с праймером промотора Т7, подвергается обратной транскрипции в комплементарную кДНК. Активность РНКазы H обратной транскриптазы впоследствии приводит к разрушению цепи РНК-мишени из гибридного дуплекса РНК-кДНК, оставляя одноцепочечную кДНК, которая включает промотор Т7. Дополнительный праймер используется для создания двухцепочечной ДНК, которая транскрибируется в РНК-ампликоны с помощью РНК-полимеразы Т7. Эти новые ампликоны РНК затем повторно входят в процесс ТМА, что способствует экспоненциальной амплификации генерировать миллиарды ампликонов РНК менее чем за 1 ч.

Анализы на основе CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками) также активно внедряются в диагностику вирусных заболеваний. CRISPR представляют собой семейство последовательностей нуклеиновых кислот, обнаруженных в прокариотических организмах. Эти последовательности могут быть распознаны и разрезаны набором бактериальных ферментов, называемых CRISPR-ассоциированными ферментами, примером которых являются Cas9, Cas12 и Cas13. Некоторые ферменты семейств Cas12 и Cas13 запрограммированы для нацеливания и разрезания вирусных последовательностей РНК [40]. На сегодняшний день две компании — Mammoth Biosciences и Sherlock Biosciences — независимо друг от друга изучают возможность использования методологии редактирования генов CRISPR для обнаружения SARS-CoV-2. Метод SHERLOCK, разработанный Sherlock Biosciences, использует Cas13, который способен разрезать последовательности репортерной РНК в ответ на активацию направляющей РНК, специфичной для SARS-CoV-2 [41]. Анализ DETECTR, разработанный Mammoth Biosciences, основан на расщеплении репортерной РНК с помощью Cas12a для специфического обнаружения вирусных последовательностей РНК генов E и N с последующей изотермической амплификацией мишени, приводящей к визуальному считыванию с помощью флуорофора [42]. Эти основанные на CRISPR методы не требуют сложной аппаратуры, проводятся быстро (анализ занимает не более 1 ч) и являются экономически выгодными. Результаты могут визуализироваться с помощью бумажных полосок, не происходит снижения чувствительности и специфичности [43].

Альтернативный метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, известный как амплификация по типу катящегося кольца (RCA), привлек значительное внимание как метод обнаружения нуклеиновых кислот, поскольку в изотермических условиях происходит 109-кратное усиление сигнала каждого круга в течение 90 мин. RCA выгодна тем, что ее можно проводить с минимальным количеством реагентов, она позволяет избежать получения ложноположительных результатов, часто встречающихся в анализах на основе ПЦР [44].

Для быстрого обнаружения вирусных нуклеиновых кислот используют высокопроизводительные тесты на микрочипах, основанные на генерации кДНК из вирусной РНК с использованием обратной транскрипции и последующего мечения кДНК специфическими зондами. Меченые кДНК загружают в лунки лотков для микрочипов, содержащих твердофазные олигонуклеотиды, закрепленные на их поверхности [45]. Анализ на микроматрицах способствует выявлению мутаций, связанных с SARS-CoV, используется для обнаружения до 24 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), связанных с мутациями в гене spike (S) SARS-CoV, с 100% точностью [45]. Способность обнаруживать различные появляющиеся штаммы SARS-CoV-2 может стать очень востребованной по мере развития пандемии COVID-19, а анализы на микроматрицах обеспечивают платформу для быстрого обнаружения новых штаммов в результате мутационной изменчивости. Одним из недостатков тестирования на микроматрицах была его высокая стоимость, однако позднее был разработан более дешевый нефлуоресцентный тест, содержащий набор олигонуклеотидов с низкой плотностью, для обнаружения нескольких штаммов коронавируса [45]. Кроме того, портативная диагностическая платформа на основе микроматричного чипа использовалась и для идентификации нуклеиновых кислот, специфичных для коронавируса MERS, а также для вирусов гриппа и др. [46].

Наиболее прогрессивным методом идентификации вирусов является метагеномное секвенирование ампликонов. Диагностическое тестирование, основанное на секвенировании вирусного генома, — важный инструмент для определения скорости и степени мутационной изменчивости, связанной с SARS-CoV-2, и для выявления вновь появляющихся штаммов вируса с целью более эффективной разработки вакцины. Метод основан на двойном подходе, включающем использование секвенирования ампликонов в дополнение к метагеномному секвенированию. Метагеномное секвенирование используется в первую очередь для устранения фонового микробиома в образцах от инфицированных людей. Это позволяет быстро идентифицировать как вирус SARS-CoV-2, так и другие патогены, приводящие к развитию вторичных инфекций, влияющих на тяжесть протекания COVID-19. Секвенирование SARS-CoV-2 и других вирусов на основе ампликонов позволяет отслеживать молекулярную эпидемиологию и эволюцию возбудителей. Метагеномные подходы, такие как SISPA (не зависимая от последовательности амплификация с одним праймером), обеспечивают дополнительный анализ расхождения последовательностей. Этот двойной метод особенно актуален для SARS-CoV-2 при оценке скорости его мутации и обнаружении возможной рекомбинации с другими коронавирусами, что имеет значение для разработки вакцин и оценки эффективности противовирусной терапии.

В своем исследовании Moore et al. (2020) [47] использовали секвенирование на основе ампликона и метагеномного секвенирования MinION для быстрого (в течение 8 ч) секвенирования генома SARS-CoV-2 и другого микробиома в мазках из носоглотки, полученных от пациентов с COVID-19. При этом были определены 16 сайтов связывания праймеров из консервативных областей в геноме SARS-CoV-2 для последовательной амплификации фрагментов размером примерно 1000 пар нуклеотидов (п.н.) с перекрывающейся областью примерно 200 п.н. Эти наборы праймеров затем использовали для создания 30 ампликонов из кДНК, которые впоследствии секвенировали с помощью MinION.

Компания Illumina, Inc. (NASDAQ: ILMN) разработала платформу для метагеномного секвенирования нового поколения, позволяющую не только обнаруживать наличие нескольких штаммов коронавирусов, но и всесторонне изучать другие патогенные организмы, присутствующие в образце. Исследование включает в себя подготовку образцов с помощью набора для истощения рРНК TruSeq Ribo-Zero Gold, подготовку библиотеки с использованием полной цепочечной РНК TruSeq, секвенирование с применением настольной системы секвенирования Illumina и окончательный анализ данных с помощью модуля LRM Resequencing или платформы IDbyDNA Explify.

Заключение

За последний год активная разработка наборов для диагностики вирусных инфекций способствовала совершенствованию молекулярно-генетических методов, особенно для тестирования в местах оказания помощи, при массовых и скрининговых исследованиях. Метод ОТ-ПЦР активно применяется во всем мире при детекции вирусной РНК, тогда как другие исследования нуклеиновых кислот, такие как изотермическая ПЦР, анализы на гибридизационных микрочипах, метагеномическое секвенирование на основе ампликонов и передовые технологии, связанные с CRISPR, все еще находятся на стадии внедрения в клиническую практику. На сегодняшний день сверхбыстрые тест-наборы и тесты в местах оказания медицинской помощи являются основным направлением разработок, что ускорит постановку диагноза и, соответственно, обеспечит свое­временное лечение, снизит процент вторичных инфекций и развития осложнений.

Сведения об авторах:

Арнаудова Кристина Шотаевна — к.м.н., заместитель руководителя НИЦ ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Мин­здрава России; 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121; ORCID iD 0000-0002-0786-73.

Ясенявская Анна Леонидовна — к.м.н., руководитель НИЦ ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Минздрава России; 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121; ORCID iD 0000-0003-2998-286.

Ростошвили Гиоргий Александрович — научный сотрудник НИЦ ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Минздрава Росси;, 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121; ORCID iD 0000-0001-7296-4798.

Самотруева Марина Александровна — д.м.н., профессор, проректор по научной и инновационной работе ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Минздрава России; 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121; ORCID iD 0000-0001-5336-4455.

Башкина Ольга Александровна — д.м.н., профессор, ректор ФГБОУ ВО «Астраханский ГМУ» Минздрава России; 414000, Россия, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121; ORCID iD 0000-0003-4168-485.

Контактная информация: Арнаудова Кристина Шотаевна, e-mail: arnaudova@mail.ru

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авто­ров не имеет финансовой заинтересованности в пред­ставленных материалах или методах.

Конфликт интересов отсутствует.

Статья поступила 25.05.2021.

Поступила после рецензирования 15.06.2021.

Принята в печать 02.07.2021.

Kristina Sh. Arnaudova — C. Sc. (Med.), Deputy Head of the Research Center, Astrakhan State Medical University; 121, Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation; ORCID iD 0000-0002-0786-73.

Anna L. Yasenevskaya — C. Sc. (Med.), Head of the Research Center, Astrakhan State Medical University; 121, Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-2998-286.

Giorgiy A. Rostoshvili — researcher of the Research Center, Astrakhan State Medical University; 121, Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-7296-4798.

Marina A. Samotrueva — Dr. Sc. (Med.), Professor, Prorector for Scientific and Innovative Work, Astrakhan State Medical University; 121, Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation; ORCID iD 0000-0001-5336-4455.

Olga A. Bashkina — Dr. Sc. (Med.), Professor, Rector, Astrakhan State Medical University; 121, Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation; ORCID iD 0000-0003-4168-485.

Contact information: Kristina Sh. Arnaudova, e-mail: arnaudova@mail.ru.

Financial Disclosure: no authors have a financial or property interest in any material or method mentioned.

There is no conflict of interests.

Только для зарегистрированных пользователей

Источник