nrnp sm что это

Nrnp sm что это

Получить результаты
Компания «Новые Медицинские Технологии»

Диагностика аутоиммунных заболеваний и синдромов

Показания к назначению анализа: диагностика и дифференциальная диагностика системных заболеваний соединительной ткани (особенно СКВ), аутоиммунного гепатита, вирусного гепатита с аутоиммунным компонентом (индуцированным вирусами или лечебными вмешательствами), первичного билиарного цирроза, рассеянного склероза; выявление аутоиммунного компонента при различных заболеваниях, в патогенезе которых может играть роль аутоагрессия. Материал для исследования: сыворотка крови.

Для определения антинуклеарных антител используется методика непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве субстрата клеток культивируемой линии Нер-2.

Использование в качестве субстрата клеток злокачественной культивируемой линии благодаря их особенностям (высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, крупные размеры, наличие большого количества митозов) позволяет оценить различные типы свечения, характерные для присутствия в образце крови широкого спектра антител к различным антигенам, имеющих различные клинические ассоциации.
Следует иметь в виду, что часть из определяемых типов свечения является высокоспецифичной, четко ассоциирована с определенными заболеваниями и имеет вполне определенную диагностическую значимость, в особенности при выявлении в высоких титрах; однако некоторые антитела к различным антигенам могут давать сходные типы свечения, в таких случаях может требоваться дальнейшее обследование для уточнения конкретного антигена, к которому направлены аутоантитела. С другой стороны, определенный тип антител может встречаться при нескольких нозологических формах. Существуют также антитела (они встречаются редко), реагирующие исключительно с компонентами веретенного аппарата клеток; обычно они не связаны с аутоиммунными заболеваниями, и их обнаружение расценивается как ложнопозитивный, не имеющий клинических ассоциаций результат.

Все вышеперечисленные особенности обязательно отражаются в лабораторном заключении, где, помимо указания типа свечения и соответствующего ему наиболее вероятного типа антител, даются также рекомендации по трактовке результатов в смысле возможной ассоциации с конкретными нозоформами или синдромами, а также необходимые дополнительные лабораторные исследования.

ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

У здоровых лиц моложе 60 лет следует ожидать отрицательных результатов на антитела к компонентам ядра и цитоплазмы; в низком титре (слабоположительный результат) эти антитела все же обнаруживаются у 2-3% (по некоторым данным, до 10%) практически здоровых людей, однако никогда нельзя предсказать, не разовьется ли у этих людей аутоиммунное заболевание в будущем (так, по данным некоторых авторов, антитела к ДНК начинают выявляться задолго до начала клинических проявлений СКВ, латентный период может продолжаться годами). После 60 лет частота слабоположительных результатов с возрастом постоянно растет. Клиническая значимость этих результатов остается неясной; как правило, они выявляются только в первичном (скрининговом) разведении 1:40. Исходя из этого, при выявлении положительного результата в скрининговом титре 1:40 всегда необходимо титрование, как минимум до диагностического титра 1:80. В любом случае представляется целесообразным последующее регулярное клинико-лабо­ра­торное наблюдение лиц, у которых выявлены ANA в низком титре.

ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Положительный результат предполагает наличие определенных заболеваний (см. ниже), однако, как и результат любых лабораторных исследований, может нуждаться в подтверждении или уточнении с помощью других методов, а также в установлении клинико-лабораторных корреляций.
Надо иметь в виду, что различные лекарственные препараты могут вызывать образование аутоантител (гидралазин, прокаинамид, фенитоин, карбамазепин, изониазид, хлорпромазин, пеницилламин, леводофа, пенициллин, фенилбутазон, пероральные контрацептивы, хинидин). Наиболее частыми мишенями для этих ятрогенных аутоантител являются ядерные гистоны, что приводит к развитию гомогенного или гомогенного периферического типа свечения.

ЗАБОЛЕВАНИЯ, ПРИ КОТОРЫХ ЧАЩЕ ВСЕГО ВЫЯВЛЯЮТСЯ

АНА ИЛИ АНТИЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА

— системная красная волчанка (СКВ),
— ревматоидный артрит,
— синдром Шегрена,
— склеродермия,
— дерматомиозит,
— узелковый периартериит и др.;

Антинуклеарные антитела также могут выявляться при острых и хронических лейкозах, приобретенной гемолитической анемии, болезни Вальденстрема, малярии, хронической почечной недостаточности, тромбоцитопениях, лимфопролиферативных заболеваниях, миастении и тимомах.

Источник

Антинуклеарные антитела, иммуноблот (аутоантитела класса IgG к 14 различным антигенам: nRNP/Sm, Sm, SS-A (SS-A нативный и Ro-52), SS-B, Scl-70, Jo-1, PM-Scl, протеин B центромера, PCNA, dsDNA, нуклеосомы, гистоны, рибосомальный белок P, AMA-M2)

Добавить в корзину

Антинуклеарные антитела представляют собой антитела к растворимым компонентам ядра клетки и в норме в организме не присутствуют. Они возникают при аутоиммунной патологии, в ходе которой иммунная система вырабатывает специфические иммуноглобулины, атакующие собственные клетки и их компоненты.

Специфические антинуклеарные антитела атакуют различные компоненты и ядра клеток. Их появление характерно для определенных аутоиммунных патологий, поэтому данный анализ используют для дифференциальной диагностики системных ревматических заболеваний.

Показания к сдаче теста на антинуклеарные антитела.

Назначают данный вид скринингового исследования для:

Показанием для проведения анализа считается выявление антинуклеарного фактора и антинуклеарных антител в крови, а также появление симптомов, характерных для заболеваний аутоиммунного характера, в частности, повышенная температура тела в течение длительного периода, снижение веса, фоточувствительность, артропатия, синдром Рейно.

Где сдать анализ на антинуклеарные антитела?

Сдать анализ крови на антинуклеарные антитела вы можете в наших центрах. Рекомендуем сделать тест при появлении первых симптомов, характерных для аутоиммунных заболеваний.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПОДГОТОВКИ К АНАЛИЗАМ КРОВИ

Кровь берется из вены. Необходимо соблюдать общие рекомендации:

Источник

Иммуноблот антинуклеарных антител

Описание

Синонимы (rus): Антинуклеарные антитела, специфичные АНА, антитела к экстрагируемым ядерным антигенам, антитела к экстрагируемым нуклеарным антигенам, анти-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, dsDNA, CENT-B, Jo-1, к гистонам, к нуклеосомам, Ribo P, AMA-M2

Синонимы (eng): ANA, ANA profile, antinuclear antibodies comprehensive profile, ANA-specific antibodies, anti-Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, dsDNA, CENT-B, Jo-1, histone, nucleosome, Ribo P, AMA-M2

Биоматериал: Венозная кровь

Показатель(и): Антитела к антигенам: Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа/52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENT-B, Jo-1, dsDNA/гистоны/, нуклеосомы, Ribo P, AMA-M2

Метод(и): Иммуноблот

Тип контейнера и особенности преаналитики: Биохимическая пробирка с активатором свертывания,6 мл (красная или коричневая крышечка)

Антинуклеарные антитела являются характерным маркером для диффузных заболеваний соединительной ткани, аутоиммунных заболеваний печени и некоторых других болезней. Это семейство антител, связывающее рибонуклеиновые кислоты, а также белки, с ними взаимодействующие. На данный момент известно около 200 аутоантител этого семейства, однако в клинической лабораторной диагностике оправдано определение лишь наиболее распространенных из них. Благодаря иммуноблоту антинуклеарных антител есть возможность одновременного исследования 15 антител данного семейства. Поскольку каждое антитело характерно для какого-либо одного или нескольких заболеваний, возникает возможность дифференциальной диагностики внутри группы аутоиммунных болезней. Кроме того, определённые антитела могут отвечать за развитие определенной клинической картины внутри единой нозологической единицы. Таким образом, обнаружение специфического антитела является предиктором развития определенной клинической картины у пациента. Условно можно сказать, что иммуноблот антинуклеарных антител является тестом второго уровня, и целесообразность его использования возникает при обнаружении антинуклеарных антител посредством проведения тестов на выявление антинуклеарного фактора и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА). Если данные тесты обеспечивают высокую чувствительность для выявления антинуклеарных антител, то иммуноблот характеризуется высокой специфичностью для отдельных аутоиммунных заболеваний. Следует заметить, что на данный момент обнаружены не все типы антинуклеарных антител и, кроме того, не все известные типы используются в лабораторной диагностике. Таким образом, результат иммуноблота может быть отрицательным, и это не обязательно исключает диагноз аутоиммунный патологии.

Когда назначается

Тест показан для диагностики и дифференциальной диагностики следующих состояний: системная красная волчанка, подострая кожная волчанки и другие разновидности кожной волчанки, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шегрена и ассоциированные заболевания, диффузная и локализованная склеродермия, CREST синдром, воспалительные миопатии (полимиозит и дерматомиозит), ювенильный хронический артрит, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит.

Подготовка к анализу

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется забор крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.Не курить в течение 30 минут до исследования.

Интерпретация

Тест является полуколичественным, что означает, что результат для каждого антигена представляется в «крестах», которые отражают концентрацию и аффинность антитела. Антитела к антигену Sm (Smith) являются высоко специфичными для системной красной волчанки. Анти-Sm направлены против 7 белков (B/B’, D1, D2, D3, E, F, G), составляющих ядро малого ядерного рибонуклеопротеина, и их определение входит в критерии СКВ с 1997 года. Антитела к SS-A (Ro52), интерферон-индуцируемому протеину, являются непецифичными и обнаруживаются при многих аутоиммунных заболеваниях. Так, антитела к данному антигену могут быть обнаружены при системной красной волчанке, её кожных формах, ревматоидном артрите, аутоиммунных заболеваниях печени, болезни Шегрена и так далее. Антитела к SS-A (Ro60) являются значительно более специфичными и отмечаются при классической системной красной волчанке, изолированно при кожной форме системной красной волчанке, а также являются основным показателем болезнь Шегрена. При обнаружении данного антитела у беременной, страдающей волчанкой, риск врожденной красной волчанки у её ребенка значительно повышается. Антитела к SS-B наиболее характерны для синдрома Шегрена (в этом случае типично обнаружение совместно с SS-A), а также для системной красной волчанки. PCNA-антитела обнаруживаются при системной красной волчанки с повышенным риском волчаночного нефрита. Антитела к рибосомам (Ribo P) обнаруживаются при системной красной волчанки в случае повышенного риска вовлечения центральной нервной системы. Антител к нуклеосомам наиболее значительно коррелирует с системной красной волчанкой с картиной волчаночного гломерулонефрита. Антитела к двуспиральной ДНК является маркером системной красной волчанки, внесённым в критерии ее диагностики с 1997 года. Антитела к snRNP/Sm являются неспецифическими и могут свидетельствовать как о смешанном заболевании соединительной ткани, так и о склеродермии или системной красной волчанке с низким риском почечного вовлечения. Антитела к гистонам характерны для лекарственной волчанки, склеродермии. Повышение титра антител к Scl-70 свидетельствует о системном склерозе с диффузным поражением кожи и внутренних органов. Выработка антител к PM-Scl достаточно специфично свидетельствует в пользу склеродермии, сопровождающейся полимиозитом. Обнаружение антител к антигену CENT-B свидетельствует о развитии CREST-синдрома, сопровождающегося склеродактилией, телеангиоэктазией, подкожными кальцинатами, синдромом Рейно и эзофагитом. Синтез антител к Jo-1 характерен для полимиозита в виде антисинтетазного синдрома. Антитела к AMA-M2 могут встречаться при первичном билиарном циррозе или синдроме Шегрена.

Источник

Иммуноблот антител IgG и IgM к боррелиям (14 антигенов)

Описание

Синонимы (rus): Нейроберрелиоз, боррелиоз
Синонимы (eng): Neuroborreliosis

Биоматериал: Венозная кровь

Показатель(и): Антитела к p18, p19, p20, p21, p58,OspC (p25), p39, p41, p83, LBb, LBa,VlsE Bg, VlsE Bb, VlsE Ba

Метод(и): Метод иммуноблота

Тип контейнера и особенности преаналитики: Биохимическая пробирка с активатором свертывания,6 мл (красная или коричневая крышечка)

Данное исследование выявляет антитела к 14 антигенам Borrelia afzelii (Ba), Borrelia garinii (Bg) и Borrelia burgdorferi sensu stricto (Bb), что позволяет не только подтверждать диагноз боррелиоза, но также и определять стадию болезни, тип возбудителя и оценить ответ на проводимую терапию. В связи с персистенцией возбудителя, во многих случаях иммунологический ответ не подчиняется классическим законам IgM–IgG перехода, поэтому даже в хронических стадиях заболевания могут преобладать антител класса IgM. В связи с этим, рекомендуется проводить тестирование антител к боррелиям класса IgG и IgM. При подозрении на нейроборрелиоз рекомендуется исследование интратекальной продукции антител к Borrelia burgdorferi.

Подробное описание исследования

Главная задача иммунной системы состоит в том, чтобы защитить организм от патогенных бактерий, вирусов и других микроорганизмов как при первом контакте с ними, так и при повторном.

Аллергия возникает, когда человек реагирует на вещества, которые безвредны для большинства людей. Эти вещества известны как аллергены. Ими могут служить частицы пыли, шерсти и перхоти животных, вещества, выделяемые насекомыми и клещами, а также плесень, пыльца. Выделяют большую группу пищевых аллергенов, среди них часто встречается реакция на пшеницу, мед, шоколад, орехи.

Всем аллергическим реакциям предшествует бессимптомная первая встреча с аллергеном, при котором уже сформировались специфические иммуноглобулины класса E (IgE). При повторной встрече IgE вступают с провоцирующим аллергию веществом в реакцию и вызывают высвобождение из так называемых тучных клеток (разновидность иммунных клеток) веществ, способствующих появлению симптомов аллергии.

Проявлениями этого заболевания могут быть:

Различные вещества растительного и животного происхождения служат причиной развития аллергии. С помощью обнаружения специфических антител IgE в крови можно идентифицировать аллергены, что важно для предотвращения симптомов аллергии.

RIDA-иммуноблот представляет собой панель, содержащую 20 аллергенов. Он с высокой долей вероятности позволяет выявить вещества, провоцирующие аллергию.

Состав теста:

Интерпретация

Отсутствие антител к антигенам Borrelia spp. классов IgG и IgM с высокой вероятностью исключает диагноз болезни Лайма (клещевой боррелиоз, Лайм-боррелиоз). Тест может быть отрицательным на ранней стадии инфицирования (антитела класса IgМ появляются через 2-3 недели, класса IgG — через несколько недель после укуса заражённого клеща); у пациентов с иммуносупрессией, связанной с гуморальным дефицитом, тяжелыми соматическими заболеваниями или под действием медикаментозной терапии, а также может указывать на отсутствие инфицирования Borrelia afzelii (Ba), Borrelia garinii (Bg) или Borrelia burgdorferi sensu stricto (Bb). Положительный результат определения антител к антигенам Borrelia spp. классов IgG или IgM может свидетельствовать о наличии инфицирования Borrelia afzelii (Ba), Borrelia garinii (Bg) или Borrelia burgdorferi sensu stricto (Bb). Результат исследования по антителам класса IgG следует считать положительным на боррелиоз при одновременном обнаружении не менее двух показателей, либо при высокоположительном результате определения IgG к VisE. Результат исследования по антителам класса IgM считается положительным при обнаружении антител к OspC, либо при наличии хотя бы одного положительного результата для IgM по VisE Bb, р41 и р39. При наличии слабоположительного ответа по IgM к OspC и отсутствии IgM к VisE Bb, р41 и р39 результат исследования считается сомнительным, может указывать на раннюю стадию инфицирования и требует повторного анализа через 1-2 недели.

Иммуноблот антифосфолипидных антител, IgG и IgM

Иммуноблот антифосфолипидных антител – иммунологическое исследование, позволяющее в одном лабораторном тесте провести анализ на несколько аутоантител, ассоциированных с развитием антифосфолипидного синдрома.

Синонимы русские

Синонимы английские

APS Immunoblotting, Antiphospholipid Antibodies Assay, Western Blot Analysis for the detection of Antiphospholipid Syndrome.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Антифосфолипидный синдром – аутоиммунное заболевание, клинически характеризующееся артериальными и венозными тромбозами, акушерской патологией (прежде всего – привычное невынашивание беременности в I и II триместрах и преждевременные роды), тромбоцитопенией и связанное с циркуляцией в крови антифисфолипидных антител.

Антифосфолипидные антитела не только являются лабораторным маркером АФС, но и играют ведущую роль в патогенезе его клинических проявлений. АФЛА обладают способностью воздействовать на процессы, составляющие основу регуляции системы свертывания крови, сдвигая равновесие в ней в сторону гиперкоагуляции – то есть тромбообразования. Процесс тромбообразования включает взаимодействие АФЛА с фосфолипидами мембран тромбоцитов, эндотелия (клеток, выстилающих изнутри кровеносные сосуды) и связанными с фосфолипидами плазменными белками. При АФС потенциально могут поражаться сосуды любого калибра – от капиллярного русла до крупных артерий, что обуславливает чрезвычайно разнообразный спектр клинических проявлений заболевания.

Антифосфолипидные антитела представляют собой семейство иммуноглобулинов разных классов (IgA, IgM и IgG), которые распознают определенные участки молекул фосфолипидов. Однако, согласно последним исследованиям, выяснилось, что главными мишенями АФЛА являются не сами фосфолипиды, а связывающиеся с ними белки плазмы, так называемые кофакторы. Комплекс кофактор-фосфолипид формирует новую молекулярную последовательность, к которой вырабатываются специфические антитела.

Таким образом, АФЛА реагируют с гетерогенной группой фосфолипидов и белковых антигенов плазмы крови, к которым относятся:

Повышенный риск развития инфаркта миокарда на фоне АФС был подтвержден после обнаружения в спектре АФЛА антител к окисленным липопротеинам низкой плотности, играющих ведущую роль в патогенезе атеросклероза.

Используемые в настоящее время диагностические критерии антифосфолипидного синдрома, принятые в 2006 году в Сиднее, помимо двух клинических параметров (тромбозы и акушерская патология), включают также три лабораторных признака – волчаночный антикоагулянт (определяется в фосфолипид-зависимых тестах на свертывание крови), а также антитела к кардиолипину и антитела к β2-гликопротеину I классов IgM и IgG, определяемые методом иммуноферментного анализа.

Несмотря на высокую специфичность, применение для диагностики АФС только этих лабораторных критериев не всегда достаточно – тесты могут быть отрицательными при наличии клинических проявлений антифосфолипидного синдрома. Поэтому при наличии у пациента симптомов АФС и отрицательных результатах критериальных лабораторных параметров дополнительно используют определение антител к другим фосфолипидам) и кофакторным белкам.

Для исследования широкого спектра антифосфолипидных антител используется метод иммунного блотинга. В его основе лежит иммунологическое взаимодействие антитела со специфичным антигеном. Выпускаемые производителем тест-системы для иммуноблота содержат нитроцеллюлозные полоски, на которых фиксированы антигены фосфолипидов и кофакторных белков. На полоску наносят исследуемую сыворотку, при наличии в ней АФЛА они связываются каждый со своим антигеном. Визуализацию образованных иммунных комплексов проводят путем добавления специального фермента и красителя. При наличии в сыворотке антифосфолипидных антител на полоске в зонах, соответствующих отдельным антигенам, появятся окрашенные полосы – так фиксируется положительный результат. Интенсивность окраски полосы можно дополнительно описывать количеством плюсов – это косвенно отражает концентрацию и аффинность (степень сродства) антител.

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

Что означают результаты?

Иммунный блотинг — это качественный тест, он дает ответ в формате «обнаружено» или «не обнаружено». Выявление АФЛА свидетельствует в пользу диагноза «антифосфолипидный синдром», однако положительные результаты должны оцениваться только вместе с клинической картиной.

Что может влиять на результат?

Около 5 % здоровых людей имеют повышенный титр АФЛА, чаще это лица пожилого возраста – с возрастом процент АФЛА-позитивных людей, не страдающих АФС, увеличивается. Частота выявления антифосфолипидных антител увеличивается также у больных воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (сифилис, ВИЧ-инфекция, вирусный гепатит С, герпес-вирусная инфекция), злокачественными новообразованиями, а также на фоне приема некоторых лекарственных препаратов (психотропные средства, оральные контрацептивы). Таким образом, любой из лабораторных признаков при отсутствии клинических симптомов не является достаточным условием для постановки диагноза «АФС».

Важные замечания

Помимо первичного антифосфолипидного синдрома, существует также вторичный, возникающий на фоне других заболеваний соединительной ткани. При этом у некоторых пациентов появление признаков АФС может предшествовать появлению симптомов первичного соединительнотканного заболевания (системная красная волчанка, узелковый периартериит, системная склеродермия, ревматоидный артрит). Поэтому при обследовании пациентов с предполагаемым АФС в программу диагностики следует включать определение антинуклеарного фактора в качестве скринингового теста.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Гематолог, ревматолог, акушер-гинеколог, ангиохирург, пульмонолог, терапевт, врач общей практики.

Литература

Что такое вестерн-блоттинг?

Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.

В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.

Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.

После проведения ДСН — электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.

Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха­низм, компоненты, применение.

Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.

После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.

1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).

Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.

Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.

Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.

Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.

Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.

Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.

Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.

Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А — с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б — первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.

Протокол:

I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).

Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.

После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.

Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.

II. Электроперенос

Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.

Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте.

Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.

Кому и когда назначают

Основные показания к назначению иммуноблота:

Как и ИФА, исследование информативно после появления в крови специфических антител, то есть через 3-4 недели от момента проникновения возбудителя. Именно в этот период белковые соединения можно обнаружить с помощью иммуноблота.

Когда анализ вестерн-блот может быть неточным:

Подтверждением наличия возбудителя в таких случаях являются положительные данные, полученные при повторных исследованиях крови на наличие вирусной РНК. Анализ проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Источник