nasba или пцр что лучше
Современные методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и реакция транскрипционной амплификации НАСБА в реальном вреиени – эффективные инструменты лабораторной диагностики урогенитальной хламидийной инфекции
Распространенность хламидийной инфекции
Хламидийная инфекция (ХИ) относится к наиболее распространенным инфекциям, передаваемым половым путем (ИППП). По данным Всемирной Организации Здравоохранения во всем мире ежегодно регистрируется около 90 млн. новых случаев ХИ. Согласно ежегодным отчетам CDC заболеваемость хламидийной инфекций неуклонно возрастает – за десять лет с 1996 г по 2005г. число новых случаев хламидийной инфекции на 100 тыс. населения регистрируемых в год увеличилось с 190 до 332 [1]. В Российской Федерации в 2004 г уровень заболеваемости составил 101 случай (на 100 тыс. населения) и, по-видимому, это лишь малая часть реально инфицированных лиц [2]. Наиболее часто инфекции подвержена сексуально активная часть в возрасте 17-25 лет.
Роль хламидийной инфекции в репродуктивной патологии
Клиническое и социальное значение УХИ заключается не столько в развитии острой инфекции, которая, как уже отмечалась, в большинстве случаев протекает малосимптомно, сколько развитии осложнений вызванных этой инфекцией. Длительное бессимптомное течение создает благоприятные условия для распространения инфекции с нижних отделов урогенитального тракта на органы малого таза, а также для передачи возбудителя другим половым партнерам. У мужчин наиболее частое осложнение – эпидидимит. У женщин – восходящая инфекция может приводить к развитию ВЗОМТ в форме эндометрита, сальпингита, сальпингоофорита, перигепатита, которые в свою очередь могут заканчиваться серьезными нарушениями репродуктивной функции с развитием эктопической беременности и трубного бесплодия.
Другой особенностью ХИ, как впрочем, и ряда других ИППП является отсутствие специфических клинических признаков, позволяющих поставить этиологический диагноз. Этиологическими агентами цервицита, ВЗОМТ могут быть гонококки, микоплазмы и другая патогенная и условно-патогенная флора. В последние годы отмечается высокая частота смешанных инфекций, вызванных сочетанием нескольких патогенных и/или условно-патогенным микроорганизмов. Обнаружено, что хламидийная инфекция сопровождает гонококковую инфекцию в 40% у женщин и 10-20% мужчин. В 75% ХИ сопровождается инфекцией, вызванной условно-патогенными микроорганизмами – рода Ureaplasma [8, 9].
Подытоживая вышесказанное, следует еще раз подчеркнуть, что с одной стороны далеко не каждый случай ХИ заканчивается развитием тяжелых последствий, с другой стороны прогностические маркеры развития осложненных форм заболевания на данный момент изучены крайне слабо, и, наконец, значительная часть осложнений развивается на фоне длительного бессимптомного течения. В связи с этим, общая мировая практика направлена на выявление максимального числа инфицированных лиц, прежде всего на ранних сроках инфекции, и лечение всех пациентов с установленной ХИ, а также их половых партнеров независимо от наличия и выраженности клинических проявлений. При этом этиологический диагноз урогенитальной ХИ устанавливается только при обнаружении возбудителя – C.trachomatis с помощью лабораторных методов.
Классические методы диагностики хламидийной инфекции
Метод клеточной культуры
Долгое время «золотым стандартом» диагностики ХИ являлся бактериологический метод, основанный на культивировании хламидий в эукариотических клеточных линиях. Несмотря на то, что указанный метод позволяет выделить возбудитель в чистой культуре, что является наиболее бесспорным доказательством инфекции, с точки зрения рутинного лабораторного исследования культуральный метод имеет ряд недостатков.
Поскольку хламидии – облигатные внутриклеточные паразиты, как и вирусы, то их культивирование в условиях in vitro проводят, используя эукариотические клеточные линии McCoy или HeLa. Постоянное подержание клеточной культуры в состоянии, необходимом для высокоэффективного заражения хламидиями из клинического материала, процедуры пассажей, анализа и интерпретации результатов исследования включают большое количество ручных манипуляций, требуя очень высокой квалификации персонала и большого опыта работы. Сам клинический материал необходимо хранить в условиях, обеспечивающих сохранение жизнеспособности и инфекционных свойства возбудителя. Для получения результатов исследования, особенно при низкой посевной дозе возбудителя необходимо проводить серию пассажей, а окончательный анализ культурального исследования осуществляется через 48-72 часов.
Наконец, персоналу приходится постоянно работать с высококонцентрированным инфекционным материалом, получаемым в процессе культивирования клинических изолятов, что предъявляет высокие требования к биологической безопасности лабораторий [8]. В связи с этим метод не пригоден для скрининговых исследований, к тому же, будучи методом с практически абсолютной специфичностью, как показали результаты многочисленных экспериментов диагностическая чувствительность культурального метода находится не превышает 90%
[ 10 ].
Наличие C.trachomatis-антиген-содержащих структур определяют по характерной картине свечения. Несмотря на то, что выполнение всей процедуры не требует дорогостоящего оборудования и большого количества манипуляций, анализ и интерпретация результатов требует хорошо обученного квалифицированного персонала, значительного времени для подробного и тщательного изучения каждого полученного препарата. Интерпретация результатов ПИФ в значительной степени зависит от качества получения материала, в первую очередь из цервикального канала, который в норме содержит достаточное количество слизи. Неправильно полученный материал, без достаточного количества эпителиальных клеток, с избытком слизи может снизить диагностическую чувствительность в 10 раз. [11].
В 1986 г. Коллегия Патологов Америки инициировала комплексную оценку использования метода ПИФ для диагностики хламидийной инфекции проводимой разными лабораторями США. В отчетном докладе по результатам за 1986-1992гг. указывается на значительные расхождения в выполнении процедуры фиксации, учета количества элементарных частиц, необходимых для положительного заключения о наличии инфекции, используемых в работе антител. Снижении порога значимости ниже 10 флуоресцирующих включений в поле зрения приводило к снижению специфичности теста. Авторы отчета подчеркивают, что в значительной степени результаты зависели от подготовленности, опыта и длительности работы лабораторного персонала [10].
Диагностическая чувствительность иммуноморфологических методов находится в пределах от 50-80%. Помимо описанных методов, как исторический этап в развитии лабораторной диагностики хламидийной инфекции использовались и цитоскопические методы с окраской по Романовскому-Гимзе, однако чувствительность и специфичность данных методов уступала методу ПИФ и тем более культуральному.
Более того при ранней и неосложненной инфекции контакт с центральным звеном иммунной системы долгое время остается минимальным, не позволяя добиться уровня ее сенсибилизации, необходимого для выработки достаточной для определения количества антител. В этом случае даже определение ранних антител – IgM в большинстве случаев не эффективно. К этому следует добавить то, что хламидии являются слабыми иммуногенами, а воспалительная реакция носит преимущественно местный характер.
Использование данных методов для диагностики ранней и хронической неосложненной хламидийной инфекции малоинформативно. Ценность результатов серологических исследований возрастает при изучении этиологии ВЗОМТ, трубного бесплодия, особенно когда отсутствует возможность использования прямых методов диагностики. В этом случае, высокие титры антихламидийных антител, нарастающие в динамике могут служить диагностическим маркером патологического процесса, вызванного C.trachomatis. Однако окончательное установление этиологии заболевания требует прямого доказательства наличия возбудителя в очаге.
В заключение обзора традиционных методов диагностики ХИ нельзя не обойти важнейшую тему контроля качества лабораторных исследований и преемственности результатов диагностики, выполненных в разных лабораториях. К сожалению, указанные методы, обладая значительной долей субъективности, не позволяют обеспечить стандартизацию лабораторных исследований в рамках разных лабораторий, а также проводить внешний контроль качества. Это в свою очередь затрудняет оценку получаемой информации о заболеваемости хламидийной инфекцией, объективности и правомочности поставленных диагнозов.
Очевидно, что дальнейшее развитие лабораторных инструментов диагностики ХИ призвано компенсировать эти недостатки. Таким образом, решение задачи максимально полного выявления инфицированных лиц предполагает разработку новых методов диагностики, обладающих наибольшей аналитической чувствительностью и специфичностью, объективностью оценки результатов исследования и позволяющих проводить масштабные скриниговые исследования. Проведенный анализ результатов большого количества лабораторий в США показал, что от 20% до 40% случаев хламидийной инфекции могут быть пропущены при использовании традиционных рутинных методов диагностики ХИ [12].
Молекулярно-биологические методы диагностики хламидийной инфекции
Методы гибридизационного анализа
Исторически первыми молекулярно-биологическими методами стали методы, основанные на гибридизационном анализе с использованием олигонуклеотидных зондов. В отечественной литературе данные методы упоминаются как методы ДНК-, РНК-зондов. Олигноуклеотидные зонды – короткие искусственно синтезируемые молекулы ДНК или РНК, нуклеотидная последовательность которых комплементарна специфическому участку генома микроорганизма. В случае наличия ДНК возбудителя в исследуемом образце зонд связывался с комплементарным участком, а результат такого связывания обнаруживался благодаря наличию в составе зонда радиоактивной или позже нерадиоактивной метки.
Методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК)
Тем самым, МАНК обладают наибольшей на сегодняшний день аналитической чувствительностью, что позволяет добиться обнаружения даже минимальных количеств микроорганизмов в исследуемом материале, и как следствие, выявить максимальное число инфицированных лиц, включая тех, у которых инфекция протекает с низкой плотностью обсемененности возбудителем. Специфичность реакции главным образом определяется олигонуклеотидными праймерами, представляющими собой, как и олигонуклеотидные зонды – короткие искусственно синтезируемые молекулы ДНК. На основе имеющийся информации о структуре генома возбудителя, праймеры разрабатываются таким образом, чтобы обеспечить их взаимодействие со строго специфическим участком генома данного вида. Таким образом достигается высокая диагностическая специфичность МАНК.
Диагностическая чувствительность данных тестов находится в пределах 85-98%, а чувствительность тестов последнего поколения вплотную приближается к 100%. Кроме того, к дополнительным преимуществам этих методов следует отнести отсутствие столь высоких, как в случае бактериологических исследований, требований к условиям хранения и транспортировки клинического материала и необходимости в сохранении жизнеспособности возбудителей; и как в случае цитологических и микроскопических методов отсутствие жестких требований к качеству исследуемого материала.
Для того, чтобы объективно понимать возможности и «подводные камни» необходимо напомнить, что ПЦР-исследование на наличие возбудителя в клиническом материале включает три технологические связанные друг с другом последовательные процедуры, которые в силу специфики технологии должны выполняться в отдельных боксированных лабораторных зонах.
Первый процедура – обработка клинического материала, целью которой является экстракция и очистка нуклеиновых кислот от других клеточных или внеклеточных компонентов. Присутствующие в клиническом материале разнообразные вещества – белки, полисахариды, соли, и др. могут подавлять (ингибировать) реакцию амплификации, тем самым, приводя к появлению ложно-отрицательных результатов.
После этого проводится третья процедура, которая заключается в идентификации продуктов амплификации и окончательном анализе результатов ПЦР-исследования. Наиболее распространенным способом детекции продуктов ПЦР в нашей стране до последнего времени оставался электрофорез в агарозном геле – метод простой, не требующий дорогостоящего оборудования, но создающий высокий риск контаминации продуктами амплификации. Процедура детекции состоит в извлечении продукта амплификации из пробирок и внесение в агарозный гель для электрофоретического анализа.
Собственно говоря, риск контаминации продуктами амплификации – основной «подводный камень» препятствовавший широкому внедрению ПЦР в рутинную лабораторную практику и вызывающий скепсис относительно достоверности результатов ПЦР-исследования. В этих условиях основным способом снижения риска контаминации ампликонами служит строгое соблюдение существующих правил организации ПЦР-лаборатории, предполагающее разделение лаборатории на зоны для проведения разных процедур ПЦР-анализа (обработки клинического материала, постановки ПЦР и проведения электрофореза) и строгое соблюдение правил поведения лабораторного персонала в соответствующих зонах.
ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) – новые возможности диагностики хламидийной инфекции
Первые работы посвященные ПЦР-РВ появились в начале 90-годов прошлого века. В работе [14] возможность регистрации накопления сигнала флуоресценции флуоресцентных красителей, которые связываются с накапливаемыми в процессе реакции ампликонами, и используются при гель-электрофорезе. Однако по-настоящему использование всех возможностей метода ПЦР-РВ стало возможным с появлением технологии флуоресцентно-меченных зондов (ФМ-зондов), которые добавляются в ПЦР-смесь и при появлении специфического продукта амплификации гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня флуоресцентного сигнала. Для этих целей разработаны специальные приборы, совмещающие в себе амплификатор и флюориметрический детектор.
Как уже стало очевидным, ПЦР-РВ не предполагает пост-амплификационный анализ продуктов реакции и извлечение контаминационно-опасного содержимого пробирок. Следовательно, значительно снижается риск контаминации и отпадает необходимость в отдельной лабораторной зоне. Еще больше увеличивается объективность интерпретации результатов ПЦР-исследования, поскольку обработка ведется с помощью программного обеспечения прибора. Значительно, практически в два раза, сокращается общее время исследования позволяя получить результат уже через 1.5 – 2 часа после поступления клинического материала в лабораторию. За рубежом компанией Abbott Molecular Inc. разработана и выпускается автоматическая платформа для выявления C.trachomatis и N.gonorrhoeae на основе технологии ПЦР-РВ. [15].
Достоинство и преимущество метода ПЦР-РВ состоит не только в упрощении организации ПЦР-лаборатории и увеличении достоверности результатов ПЦР-анализа. Данный метод впервые позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК микроорганизма в клинической пробе. Еще на заре первых работ посвященных методу ПЦР-РВ был сделан крайне важный вывод о прямой зависимости исходного количества амплифицируемой ДНК и началом регистрации флуоресцентного сигнала [14]. На основании чего были разработаны протоколы определения концентрации ДНК возбудителей, имеющие важное клиническое и диагностическое значение.
В литературе имеются работы, которые показали, что существует корреляция между выраженностью клинических проявлений при ХИ и концентрацией C.trachomatis в отделяемом урогениального тракта. [16]. Анализируя причины неудачи терапии некоторых пациентов с ХИ, делается предположение о возможной связи между исходной высокой плотностью колонизации хламидиями и формированием гетеротипической устойчивости хламидий к антибактериальным препаратам. Возможно, что определение исходной концентрации ДНК C.trachomatis позволит в дальнейшем прогнозировать ответ на антибактериальную терапию и выбирать наиболее оптимальную схему лечения. Кроме того, выявление низкой концентрации ДНК C.trachomatis в отделяемом урогенитального тракта позволит более объективно оценивать и объяснять несовпадающие результаты амплификационных и не-амплификационных методов диагностики ХИ.
В нашей стране уже разработаны тест-системы на основе ПЦР-РВ и налажено их серийное производство. Тест-системы производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора с торговой маркой «Амплисенс» для выявления C.trachomatis и возбудителей других ИППП прошли Государственную регистрацию и получили Регистрационные удостоверения Росздравнадзора.
NASBA-Real-Time (реакция транскрипционной амплификации НАСБА в реальном времени)
В 1991г. в оптимизированном и более совершенном виде технология на основе 3SR была использована для диагностики ВИЧ под названием NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). В настоящее время NASBA является запатентованным названием технологии, на базе которой выпускаются коммерческие наборы реагентов с торговой маркой «NucliSens» (bioMerieux, Франция). Близким аналогом реакции НАСБА является упомянутая выше реакция транскрипционной амплификации ТМА, запатентованная компанией GenProbe (США).
Во-вторых, РНК гораздо менее стабильный по сравнению с ДНК материал и результаты диагностики на основе НАСБА могут более адекватно отражать эффективность проводимой антибактериальной терапии. Поскольку ДНК C.trachomatis благодаря своей стабильности может достаточно долго выделяться из урогенитального тракта после успешно проведенной терапии, то контроль излеченности рекомендовано проводить через 3-4 недели после окончания лечения. В то же время РНК достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении клетки, поэтому на основании РНК-диагностики можно более точно судить о наличии или отсутствии жизнеспособных возбудителей и текущей инфекции. Первые результаты по возможности использования реакции НАСБА как инструмента контроля эффективности лечения были описаны в работе [17]. Было показано, что РНК C.trachomatis не определялась ни у одного больного через неделю после окончания терапии, в то время как ДНК обнаруживалась у некоторых больных на протяжении еще 2-, 3-х недель. Проведенные в нашей стране исследования также показали, при эффективном лечении элиминация РНК C.trachomais осуществляется значительно быстрее, чем ДНК. В результате реакция НАСБА позволяет не только добиться высокой чувствительности при обнаружении C.trachomatis, но при этом обнаруживать жизнеспособные микроорганизмы.
Разработка коммерческих тест-систем на основе реакции НАСБА стала возможной после появления технологии ФМ-зондов. В отличие от метода ПЦР для анализа продуктов реакции НАСБА использование метода гель-электрофоореза малоинформативно, поэтому в нашей стране данная методика долгое время оставалась неизвестной. Благодаря технологии ФМ-зондов стало возможным регистрировать накопление продуктов амплификации в режиме реального времени, по аналогии с ПЦР-РВ[…]. В результате с использование базовых реагентов для реакции НАСБА («Nuclisens Basic Kit») и специфических для C.trachomatis праймеров и ФМ-зондов была разработана тест-система «Амплисенс Chlamydia trachomatis-РИБОТЕСТ», успешно пройдя Государственные испытания получила Регистрационное свидетельство Росздравнадзора.
В заключении следует отметить, что в нашей стране сложилась благоприятная ситуация, позволяющая благодаря новым технологиям, таким как ПЦР в реальном времени и НАСБА поставить диагностику хламидийной инфекции на качественно более высокий уровень. Создана производственно-технлогическая база для выпуска стандартизованных и зарегистрированных коммерческих тест-систем, парк необходимого оборудования и разработанных лабораторных технологий диагностики. Широко внедрение данных технологий в масштабе всей страны позволит наладить программу раннего выявления ХИ, обеспечить мониторинг результатов проводимого лечения, и тем, самым снизить последствия этого тяжелого заболевания.
Nasba или пцр что лучше
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
Сравнительная оценка аналитической чувствительности методов микроскопии (нативного и окрашенного препаратов) и амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА в реальном времени) при обнаружении Trichomonas vaginalis
Журнал: Клиническая дерматология и венерология. 2011;9(2): 28-35
Рыжих П. Г., Гущин А. Е., Савочкина Ю. А. Сравнительная оценка аналитической чувствительности методов микроскопии (нативного и окрашенного препаратов) и амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА в реальном времени) при обнаружении Trichomonas vaginalis. Клиническая дерматология и венерология. 2011;9(2):28-35.
Ryzhikh P G, Gushchin A E, Savochkina Iu A. Comparative evaluation of analytical sensitivity of microscopic methods (wet mount and fixed) and nucleic acid amplification assays (real time PCR and NASBA) for the detection of Trichomonas vaginalis. Klinicheskaya Dermatologiya i Venerologiya. 2011;9(2):28-35.
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
В настоящее время существуют три основных метода для лабораторного выявления Trichomonas vaginalis: микроскопия нативного или окрашенного препаратов, культуральное исследование и выявление нуклеиновых кислот T. vaginalis с помощью методов амплификации нуклеиновых кислот. Целью исследования явилось прямое сравнение пределов обнаружения T. vaginalis с помощью микроскопии нативного и окрашенных препаратов и коммерческих наборов реагентов марки АмплиСенс, производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора на основе методов ПЦР и НАСБА в реальном времени. Установлено, что значения предела обнаружения методов ПЦР и НАСБА в реальном времени в 100-1000 раз ниже по сравнению с методом микроскопии, что обеспечивает методу амплификации нуклеиновых кислот значительно более высокую аналитическую чувствительность.
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва
Лабораторные методы играют важнейшую роль в обследовании пациентов с подозрением на инфекции, передаваемые половым путем (ИППП). Долгое время согласно приказу №1570 от 4 декабря 1986 г. [1] регламентированными методами диагностики трихомониаза считали микроскопию нативного или окрашенного препаратов и культуральное исследование. На основании лабораторного выявления T. vaginalis с использованием указанных методов диагноз инфекции можно было считать правомочным. Однако приказом №398 от 23.12.03 [2] приказ №1570 от 4.12.86 был признан недействующим, и в настоящее время нормативно-правовая база диагностики мочеполового трихомониаза отсутствует. Разработка новых регламентирующих документов должна базироваться на объективных данных об аналитических и диагностических характеристиках различных лабораторных методов.
В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ИППП, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. В нашей стране наиболее распространенным МАНК является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Неоднократно в зарубежных исследованиях [3—5] при сравнении методов диагностики трихомонадной инфекции было показано, что диагностическая чувствительность ПЦР выше не только таковой микроскопии, но и культурального посева у пациентов как с клиническими проявлениями инфекции, так и у бессимптомных лиц. При этом наибольшей эффективностью обладает метод ПЦР в реальном времени. Кроме метода ПЦР для выявления T. vaginalis за рубежом был предложен метод определения рибосомальной РНК (рРНК) на основе реакции транскрипционной амплификации (Transcription-Mediated Amplification — TMA). На основе данного метода за рубежом уже на протяжении многих лет применяются коммерческие тесты для диагностики инфекций, вызванных C. trachomatis и N. gonorrhoeae. Достоинством данного метода является возможность выявлять прежде всего жизнеспособных возбудителей. Кроме того, благодаря высокому содержанию в клетках возбудителей рРНК метод позволяет обнаруживать в клиническом материале очень малые количества микроорганизмов.
В нашей стране в ряде работ [6, 7] была показана более высокая диагностическая чувствительность метода ПЦР по сравнению с традиционными методами диагностики, в первую очередь микроскопией. В настоящее время несколькими отечественными производителями выпускаются коммерческие тесты на основе метода ПЦР для выявления ДНК T. vaginalis. Сравнительно недавно в ФГУН ЦНИИ эпидемиологии был разработан тест, который является аналогом зарубежного теста выявления рРНК T. vaginalis ТМА (Gen-Probe, США), – АмплиCенс T. vaginalis-РИБОТЕСТ на основе реакции транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic acid sequence-based amplification — NASBA). Данный тест прошел процедуру государственной регистрации и разрешен к использованию на территории Российской Федерации.
Однако, как было показано в зарубежных работах [8], эффективность метода ПЦР при выявлении T. vaginalis во многом зависит от выбранной генетической мишени простейшего, структуры используемых праймеров и гибридизационных зондов и других важных элементов тест-системы. В связи с этим для более объективной оценки разработанных и выпускаемых тестов необходимы объективные результаты сопоставления аналитических характеристик применяемых методов диагностики трихомониаза, среди которых одной из наиболее важных является предел обнаружения возбудителя.
Цель настоящего исследования — прямое сравнение пределов обнаружения T. vaginalis с помощью микроскопии нативного и окрашенных препаратов и коммерческих наборов реагентов марки АмплиCенс на основе методов ПЦР и НАСБА в реальном времени, выпускаемых ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора — АмплиCенс Trichomonas vaginalis-Fl и АмплиCенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ.
Материал и методы
Из клинического образца была получена свежая культура T. vaginalis. После микроскопического подтверждения наличия живых и подвижных трихомонад с типичной морфологией немедленно готовили серию последовательных 10-кратных разведений. Из каждого разведения отбирали аликвоты, которые параллельно исследовали с помощью микроскопии (нативного и окрашенного препаратов) и тестов на основе ПЦР и НАСБА, согласно установленным для каждого метода протоколам. Для объективизации результатов были получены две культуры (культура 1 и культура 2) от разных пациенток. Молекулярно-биологические и микроскопические тесты проводили в повторах. Схема эксперимента представлена на рисунке. 
Рисунок 1. Модельный эксперимент по установлению предела обнаружения методов выявления T. vaginalis.
Процедура получения культур клеток T. vaginalis
От пациенток, обратившихся в клинико-диагностическую лабораторию ФГУН ЦНИИЭ, получали мазки из влагалища, материал помещали в жидкую питательную среду Vagicult (производства «Orion Diahnostica», Финляндия) и инкубировали в термостате при 37°С. В случае помутнения среды культивирования отбирали аликвоты и проводили микроскопическое исследование нативного препарата, и при обнаружении трихомонад (подвижные клетки грушевидной формы) полученные образцы использовали в дальнейшей работе.
Приготовление серии разведений культур клеток T. vaginalis
Микроскопическое исследование T. vaginalis проводили двумя наиболее распространенными в лабораторной практике методами — микроскопией нативного препарата и микроскопией фиксированного препарата, окрашенного по Романовскому—Гимзе. В обоих случаях процедуры выполняли согласно установленным в лабораторной практике протоколам в соответствии с методическими рекомендациями [9]. Из каждого разведения культуры 1 и культуры 2 готовили по два стекла для каждого метода микроскопического исследования.
Микроскопия нативного препарата
Для приготовления препарата на предметное стекло наносили 10 мкл клеточной суспензии. Каплю накрывали покровным стеклом и исследовали под микроскопом Olympus BX45TF при увеличении объектива 40 и окуляра 10. Исходные препараты просматривали в 5 полях зрения. Для последующих разведений вследствие уменьшения количества трихомонад просматривали 100 полей зрения. Трихомонады обнаруживались в виде образований грушевидной, реже овальной формы, с толчкообразным характером движений. Цитоплазма трихомонад была зернистой и вакуолизированой. Ядра не обнаруживались или были плохо различимы.
Микроскопия окрашенного препарата
Окраску проводили по Романовскому—Гимзе. Высушенный на воздухе мазок фиксировали смесью Никифорова (абсолютный этиловый спирт и эфир в соотношении 1:1). Раствор краски Романовского (азур-эозин) перед употреблением разводили дистиллированной водой в соотношении 0,3 мл на 10 мл воды и пипеткой наносили на горизонтально расположенные препараты на 30—40 мин. Затем их быстро промывали водой и высушивали. Исследование проводили с помощью микроскопа Olympus BX45TF при увеличении объектива 90 и окуляра 10. Исходные препараты просматривали в 5 полях зрения. Для последующих разведений вследствие уменьшения количества трихомонад просматривали 100 полей зрения. В окрашенных препаратах трихомонады имели эксцентрично расположенное овальное пурпурно-фиолетовое ядро. Цитоплазма клеток окрашивалась в светло-синий цвет, вакуоли оставались бесцветными, оболочка клеток была четко заметна.
Определение ДНК и РНК T. vaginalis методами ПЦР и НАСБА
Исследование проводили с использованием коммерческих наборов реагентов марки АмплиCенс производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Данные наборы реагентов разрешены к использованию в клинической лабораторной практике. Все процедуры проводили в соответствии с инструкциями к указанным наборам реагентов. Образцы разведений культур непосредственно перед началом исследования перемешивали. Из каждой пробирки 3 раза отбирали по 100 мкл образца и переносили в отдельные стерильные пробирки и исследовали материал указанными методами. Согласно инструкциям к наборам реагентов в процессе исследования методом ПЦР из 100 мкл культуры получали 100 мкл очищенного препарата ДНК, из которых 10 мкл использовали в реакции амплификации, а в процессе исследования методом НАСБА из 100 мкл культуры получали 50 мкл очищенного препарата РНК, при этом в реакции амплификации использовали 5 мкл. Таким образом, объем клеточного материала был одинаков как для микроскопических, так и для молекулярных методов, использованных в работе.
Исследование методом ПЦР в реальном времени
Исследование методом ПЦР включало три процедуры — экстракцию ДНК, проведение реакции амплификации и анализ результатов. Экстракцию ДНК проводили с помощью набора ДНК-Сорб-АМ (№ФСР 2007/00183 от 13.07.09). Для ПЦР-амплификации очищенной ДНК использовали набор реагентов АмплиСенс T. vaginalis-FL (№ФС 012б2006/5190-06 от 29.12.06). Реакцию амплификации с детекцией в режиме реального времени проводили на приборе Rotor-Gene 6000 («Corbett Research», Австралия). Анализ результатов ПЦР-исследования проводили с учетом результатов контрольных образцов. Для контроля качества экстракции нуклеиновых кислот в каждый образец разведения добавляли внутренний контрольный образец (ВКО) — рекомбинантный препарат ДНК, продукт амплификации которого служил маркером эффективности исследования конкретного образца разведения. Результаты ПЦР-анализа считали положительными при наличии флюоресцентного сигнала, пересекающего пороговую линию.
Исследование методом НАСБА в реальном времени
Для проведения реакции НАСБА в реальном времени использовали набор реагентов АмплиСенс T. vaginalis-РИБОТЕСТ (№ФСР 2010/07305 от 22.04.10), который включал набор для экстракции РНК РИБОТЕСТ-Сорб и набор для амплификации участка 18S рРНК T. vaginalis РИБОТЕСТ-НАСБА. Полученные данные анализировали с учетом результатов контрольных образцов. Как и в случае ПЦР-исследования, процедуру НАСБА-исследования проводили в присутствии ВКО, в качестве которого в данном случае использовали рекомбинантный препарат РНК. Результаты реакции НАСБА считали положительными при уровне сигнала флюоресценции, превышающем пороговое значение сигнала отрицательного контрольного образца.
Установление предела обнаружения
Предел обнаружения при сравнении методов диагностики устанавливался как наибольшее разведение клеточной культуры, в котором трихомонады обнаруживались визуально при микроскопии либо обнаруживались их нуклеиновые кислоты методами ПЦР и НАСБА. При микроскопическом исследовании выявление даже одного простейшего с типичной морфологией T. vaginalis хотя бы на одном из двух стекол рассматривали как положительный результат. При молекулярно-биологическом исследовании положительный результат на ДНК или РНК хотя бы в одном из трех повторов считали положительным.
Результаты и обсуждение
Сравнения разных методов диагностики трихомониаза неоднократно проводились в нашей стране и за рубежом, но прямых экспериментов, устанавливающих предел обнаружения того или иного метода, ранее не проводилось. Однако именно предел обнаружения или аналитическая чувствительность метода в значительной степени определяют и диагностическую чувствительность. Результаты проведенного нами исследования представлены в таблице. 
В настоящее время во всем мире, в том числе и в нашей стране, существуют три основных метода для лабораторного выявления T. vaginalis: микроскопия нативного или окрашенного препаратов, культуральное исследование и выявление нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) T.vaginalis с помощью МАНК. Проведенное специалистами ФГУ ГНЦД Росмедтехнологий анкетирование лабораторий КВД Российской Федерации показало, что микроскопическое исследование является преобладающим методом при установлении диагноза трихомониаза. В 56% лабораторий применяется культуральное исследование и в 35,1% лабораторий для диагностики трихомониаза используется метод ПЦР [10].
Согласно методическим рекомендациям, по микроскопическому исследованию при диагностике трихомониаза микроскопию следует проводить сначала при малом увеличении (×100) и исследовать не менее 10 полей зрения. В своем исследовании при проведении модельного эксперимента мы полностью следовали данным рекомендациям, воспроизводя ситуацию с клиническим материалом. Однако в условиях модельного эксперимента мы были избавлены от наличия в образцах типичного содержимого клинического материала (клетки разных типов эпителия, лейкоциты, грибковая и микробная микрофлора и продукты ее жизнедеятельности), которое может значительно затруднять обнаружение клеток простейших, тем самым снижая чувствительность метода и повышая субъективизм исследования. Еще одним важным допущением явилось то, что при минимальных концентрациях простейших исследование проводилось более детально, чем это может быть в реальной практике врача-лаборанта. В нашем эксперименте мы заранее знали, что в материале могут содержаться трихомонады, и несмотря на то что методические рекомендации предписывают исследование 5—10 полей зрения, по мере увеличения разведения культуры мы исследовали до 100 полей зрения. Следует подчеркнуть, что при микроскопическом исследовании учитывались лишь результаты, основанные на визуализации клеток только с типичной морфологией влагалищных трихомонад, а при микроскопии нативного препарата учитывался и характер их движения. Поскольку исследование проводилось в кратчайшие после приготовления разведений сроки, скорость потери подвижности простейшими не выходила за рамки той, которая бывает при рутинном лабораторном исследовании. Исходя из результатов сравнения пределов обнаружения двух видов методов микроскопии, мы сделали заключение о более высокой аналитической чувствительности микроскопии окрашенного препарата. Этому есть вполне объективное объяснение. При микроскопии нативного препарата важным диагностическим критерием является подвижность простейших, по мере потери подвижности трихомонады исключались из учета, несмотря на наличие других морфологических признаков. В данном случае мы строго придерживались как отечественных, так и международных рекомендаций.
Молекулярно-биологическое исследование методами ПЦР и НАСБА мы проводили с использованием коммерческих наборов реагентов марки АмплиСенс производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, которые используются в рутинной клинической лабораторной практике Российской Федерации. По результатам настоящей работы, чувствительность метода ПЦР при использовании ПЦР-тест-системы АмплиСенс T. vaginalis-FL оказалась существенно выше чувствительности метода микроскопии окрашенного препарата. Одной из причин такой высокой чувствительности является высокая эффективность экстракции ДНК с помощью набора ДНК-Сорб-АМ, который обеспечивает максимально полное удаление ингибиторов ПЦР при минимальных потерях ДНК. Второй причиной высокой чувствительности ПЦР является использование в указанном наборе праймеров, позволяющих амплифицировать участок ДНК-повторов в геноме T. vaginalis (Trichomonas vaginalis repeated DNA target for PCR identification, GenBank: L23861.1). Помимо того, что указанные участки генома высокоспецифичны для T. vaginalis и отсутствуют у других видов трихомонад, их количество составляет 10 2 —10 3 на геном [11].
Реакция транскрипционной амплификации НАСБА в данном исследовании использовалась вследствие ее отличительных особенностей, которые дают ей преимущество перед другими методами, включая ПЦР. В первую очередь это использование в качестве мишени для амплификации фрагмента рРНК, что позволяет дополнительно повысить аналитическую чувствительность за счет того, что количество копий рРНК, входящей в состав рибосом, может достигать от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч на клетку. Метод НАСБА как независимый высокочувствительный молекулярно-биологический метод может выступать в роли референсного теста и использоваться в лабораторной практике в спорных случаях, когда результаты других прямых тестов выявления трихомонад не совпадают.
Важно отметить, что в отличие от микроскопического метода, для которого были созданы в некотором смысле идеальные условия, методика и процедура при исследованиях разведений культур методами ПЦР и НАСБА не отличались от таковых при работе с клиническим материалом, на что указывали значения контролей, использованных в молекулярных методах и свидетельствующие о качестве тестирования образцов. Это позволяет считать проведенное исследование адекватной моделью для экстраполирования полученных результатов на ситуацию в рутинном лабораторном исследовании клинического материала.
Выводы
Полученные данные объективно показывают, что наборы реагентов для ПЦР и НАСБА АмплиСенс T. vaginalis-FL и АмплиСенс T. vaginalis-РИБОТЕСТ в реальном времени для выявления нуклеиновых кислот T. vaginalis имеют значительно более низкий предел обнаружения и, следовательно, более высокую аналитическую чувствительность, показатели которой в 100 и 1000 раз соответственно выше аналитической чувствительности метода микроскопии при исследовании нативного и окрашенного препаратов. Таким образом, результаты лабораторного исследования, проведенного на основе использованных в работе наборов реагентов для ПЦР и НАСБА, более объективно указывают на наличие или отсутствие трихомонадной инфекции по сравнению с микроскопическими методами.