Что значит пцр количественно
Типы ПЦР анализа
Полимеразная цепная реакция, сокращенно ПЦР.
Представляет собой метод, используемый для экспоненциальной амплификации определенной последовательности ДНК-мишени.
Позволяющей изолировать, секвенировать или клонировать одну РНК среди многих.
ПЦР была разработана более 30 лет назад, американским биохимиком Кэри Муллисом.
Полимеразная реакция имеет широкое использование, применяется не только как анализ на ИППП.
Применение ПЦР практикуется в следующих направлениях: генотипирование:
Как правило, ПЦР представляет собой трехступенчатую реакцию.
Образец, содержащий разбавленную концентрацию матричной ДНК, смешивают с термостабильной ДНК-полимеразой.
Такой как Taq-полимераза, праймер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и магний.
На первой стадии ПЦР образец нагревают до 95-98 градусов.
На втором этапе температуру снижают до приблизительно 55-65 градусов.
На третьей стадии температуру обычно повышают до 72 градусов.
Эта последовательность денатурации, отжига, и расширения повторяется для множества циклов.
Что и приводит к экспоненциальному усилению матричной ДНК.
ПЦР достаточно сложный, но информативный метод исследования.
Зачастую применяется в диагностике патологий вирусной и инфекционной этиологии.
Анализ позволят практически со 100% точностью выявить и определить разновидность патогенного микроорганизма.
В последнее время, полимеразная реакция приобрела популярность в ранней диагностике туберкулеза.
Позволяет выявить возбудителя с 98% точностью на доклинической стадии.
Преимущества диагностики туберкулеза при помощи ПЦР:
Mycobacterium tuberculosis является внутриклеточным микобактериальным патогеном.
Представляет собой одно из самых распространенных и наиболее серьезных инфекционных заболеваний в мире.
Считается, что более 2 миллиардов людей имеют скрытую инфекцию M. Tuberculosis.
Около 8 миллионов — активную форму туберкулеза.
Кроме того, пациенты с ВИЧ и нарушением работы иммунитета на фоне заболевания чаще подвержены дополнительному инфицированию бактерией M. tuberculosis.
В их случае патология протекает сложнее, с многочисленными осложнениями.
ПЦР при подозрении на туберкулез является наиболее востребованным и точным анализом.
Способен выявить заболевание на самых ранних сроках, а также прибегнуть к своевременному, эффективному лечению.
Качественный ПЦР на гепатит С
В большинстве случаев, качественный ПЦР назначается при выявлении в организме пациента антител к гепатиту С.
Полимеразная реакция при подозрении на гепатит С проводится по следующему принципу.
Первое тестирование — на четвертую неделю после обнаружения антител.
Второе — на двенадцатую неделю, третье — на двадцать четвертую.
Далее анализ назначается на постоянной основе, один раз каждые 12 месяцев.
Проведение полимеразной реакции на гепатит Б, А, Ц позволяет получить максимально точные результаты за счет высокой чувствительности теста от 10 до 500 МЕ/мл.
Это дает возможность определять наиболее низкие показатели присутствия в организме вируса и контролировать его дальнейшее развитие.
Расшифровка результатов проводится лечащим врачом.
Положительный анализ говорить о наличии патогенного микроорганизма.
Отрицательный — чаще об отсутствии, но на 100% не исключает НСV.
Взятие анализа на проведение ПЦР НСV проводится в утреннее время, биологическим материалом является венозная кровь.
ПЦР количественный на гепатит С
Количественная полимеразная реакция назначается пациентам, уже имеющим диагноз «гепатит С».
Задача анализа выявить вирусную нагрузку на организм.
Определить количественное присутствие патогена, а также понять, насколько проводимая терапия эффективна.
Расшифровать результаты диагностического исследования поможет лечащей врач-гепатолог.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.
Суть метода ПЦР
ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.
Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.
Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.
Преимущества метода ПЦР
Какие есть недостатки
Показания к проведению ПЦР-анализа
Подготовка к проведению ПЦР-теста
Как проводится ПЦР-анализ
Результаты ПЦР-теста
Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.
Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.
По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.
Сходите к врачу
Наши статьи написаны с любовью к доказательной медицине. Мы ссылаемся на авторитетные источники и ходим за комментариями к докторам с хорошей репутацией. Но помните: ответственность за ваше здоровье лежит на вас и на лечащем враче. Мы не выписываем рецептов, мы даем рекомендации. Полагаться на нашу точку зрения или нет — решать вам.
Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать
В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:
Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.
Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.
Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.
Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.
Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.
ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.
Как подготовиться к ПЦР-анализу
Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.
В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.
Если в качестве материала выступает моча, ее нужно собирать утром, как только проснетесь, в чистый контейнер для анализов или в вымытую с мылом банку из-под детского питания.
Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.
Можно ли верить ПЦР-тесту
Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.
При этом ПЦР-анализы зачастую точнее других методов поиска возбудителя инфекционных заболеваний. Например, возбудителей гонореи у женщин можно искать под микроскопом, можно выращивать в чашке Петри, а можно определять методом ПЦР. В первом случае чувствительность анализа в пределах 36,2%, во втором — 89,7%, а в третьем — 89,9—100%. Получается, что ПЦР-анализ — самый надежный, и доверять ему можно. Примерно так же дела обстоят и с другими половыми инфекциями.
Информативность ПЦР в диагностике инфекций, передаваемых половым путемPDF, 152 КБ
Однако есть и относительно новые, менее надежные варианты ПЦР-тестов — например, на коронавирусную инфекцию. По словам Дениса Проценко, главного врача инфекционной больницы в Коммунарке, чувствительность тестов для выявления COVID-19 — 70—80%. Согласно китайским данным, чувствительность теста может быть еще ниже — в пределах 66—80%.
Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.
Хотя ПЦР-тесты на коронавирус работают хуже, чем ПЦР-тесты на половые инфекции, ничего точнее для диагностики коронавирусной болезни у нас пока нет. Врачи назначают повторный тест, если у них по результатам диагностики остаются сомнения.
Основы количественной и цифровой ПЦР. Применение в практике. Подходы к выбору технологии и реактивов. Часть 1. Суть и аппаратное обеспечение количественной ПЦР
(на основе выступления менеджера по развитию бизнеса кПЦР компании Thermo Fisher Scientific Алексея Пазилина)
Решения для генетического анализа
Сегодня для решения задач генетического анализа существует несколько направлений – NGS, КЭФ, кПЦР («реал-тайм»).
Практика показывает, что пока нет технологии, которая бы в равной степени успешно решала все задачи, и нет прибора, который бы делал все подряд.
Определенные задачи решаются с помощью дорогостоящего NGS, но в таком случае потребуется много образцов для запуска, чтобы стоимость анализа за одну точку оказалась адекватной. При этом нужно помнить, что чувствительность NGS не всегда достаточна.
Для подтверждения NGS нужно капиллярное секвенирование; если есть какие-то готовые SNP («снипы») или нужно посмотреть экспрессию отдельных генов, то проще это делать по технологии «реал-тайм». А если нужно посмотреть много точек или образцов, то приходят на подмогу микрочипы.
Thermo Fisher Scientific: краткая характеристика производителя
Это глобальная компания с большим оборотом, которая продолжает приобретать другие компании в своей сфере деятельности. На сегодня она представлена несколькими дивизионами. Один из них – Life Solutions Group – «Группа по науке о жизни», которая является продолжением Life Technologies [Corporation], Invitrogen, Applied biosystems и так далее. И представляемые ею бренды зарекомендовали себя в течение долгого времени: ThermoScientific, Applied biosystems, Invitrogen, Gibco, Iontorrent.
В их состав входит множество микробрендов, которые в свое время являлись самостоятельными компаниями.
Так, в 2020 г. оформили бренд Affymetrix (одноименная компания была куплена в 2015 г.) по производству микрочипов. Теперь это Applied Biosystems. В 2020 г. компания QIAGEN (Кайджен) начала путь к тому, чтобы стать частью Thermo Fisher.
До середины 2021 г., когда сделка по покупке этой компании закроется официально, QIAGEN и остальная часть Thermo Fisher функционируют как разные организации, Thermo Fisher не продает существующую продукцию QIAGEN и не вмешивается в его бизнес, т.е. до закрытия сделки оборудование QIAGEN продает тот, кто продавал его прежде.
Thermo Fisher представляет на рынке много продукции и покрывает его примерно на 80%.
ПЦР в реальном времени
Количественная ПЦР – она же «реал-тайм ПЦР», кПЦР – это технология, позволяющая автоматически детектировать амплификацию на каждом цикле без участия оператора и каких-либо рисков.
У «реал-тайма» огромное количество преимуществ по сравнению с «классической» ПЦР.
Области применения кПЦР
По сути «реал-тайм» и стандартная ПЦР – это одна и та же система, только туда добавлены еще зонды. Но «реал-тайм» рассчитана на небольшой фрагмент с количеством нуклеотидов от 90 до максимум 250. Поэтому в данном случае стоит говорить о детекции, но не об амплификации длинных фрагментов.
Приложения для кПЦР
Если говорить о направлениях и отраслях, где применяется кПЦР, нужно назвать:
Реализация технологии кПЦР («реал-тайм»)
Для проведения кПЦР необходимы:
2 – управляющий компьютер или компьютер, на котором происходит анализ;
3 – программное обеспечение, которое позволяет работать с этим оборудованием.
Устройство приборов для технологии «реал-тайм»
Амплификаторы для технологии «реал-тайм» имеют классическую оптическую систему, состоящую из:
Приборы могут различаться типами источника и детектора, но суть остается неизменной: получить результат и детектировать возникновение флуоресценции в каждой отдельной пробирке.
Программное обеспечение для технологии «реал-тайм»
Программное обеспечение для этой технологии делится на две части.
Первичное – то, на котором можно видеть результаты флуоресценции, логарифмические кривые или линейные графики;
Вторичное – позволяет производить оценку, расшифровку этих данных в зависимости от цели:
Калибровка приборов
У некоторых приборов, в частности, у Thermo Fisher Scientific, есть калибровки. Иногда производители говорят, что калибровать приборы не нужно, но это не совсем так, что отражено даже в инструкциях.
Картинка справа: чтобы прибор позиционировался правильно над лункой и происходило снятие флуоресценции из центра лунки, нужно учесть подвижность частей прибора. Снимать флуоресценцию следует из центра, а не из других точек, иначе произойдет искажение данных.
В связи с этим получается «подкрест каналов», когда один канал светит на другой. Этого можно избежать, откалибровав под ту краску, с которой вы работаете, прибор, который вы используете. Прибор будет «видеть» спектр вашей краски и использовать его правильно для дальнейших расчетов.
Это могут не все приборы, и это не у всех заложено в программном обеспечении. Особенно такие моменты важны для лабораторий, работающих на готовых тест-системах, а не синтезирующих себе зонды с определенными красками самостоятельно.
Например, почти у всех производителей российских тест-систем второй канал, светящийся в красках HEX, VIC, JOE – называемый желтым или зеленым – использует краску R6G. Прибор «не знает», как светится краска R6G, которая там используется – он откалиброван под другие красители. Есть вероятность, что эта краска может «зайти» на другие каналы, хотя это редкость.
На приборах QuantStudio от Thermo Fisher калибровку не стали убирать, хотя она всего лишь рекомендованная – раз в два года. Но ее стоит делать просто для того, чтобы пользователи приборов получали нормальные результаты. Доказательство пользы калибровки – успешная работа исследователей, использующих старые приборы серии 7500 и не желающие переходить на другие амплификаторы: результаты, которые они получают на своих 7500, получаются качественными, хотя в приборах используются галогеновые лампы, требующие калибровки каждые полгода(!). Кроме того, если прибор куда-либо перевезли или хотя бы переставили с места на место, целесообразно провести хотя бы калибровку по снятию данных по лункам, просто раскапав воду – это не займет много времени.
Пассивный краситель и его функция
Особенность приборов Thermo Fisher Scientific, которая присутствовала еще в одной марке оборудования, уже снятой с производства – применение пассивного красителя.
Многие производители пишут, что без него можно обойтись, так как пассивный краситель только помогает исправить неправильный оптический путь, связанный с ламповидным освещением планшета. На деле это не так.
На слайде отображены результаты, полученные на машине BIO-RAD, на нашем оборудовании и с референсным красителем: с красителем картинка нагляднее. Впрочем, это не обязательная опция. В качестве референсного красителя можно использовать любую краску.